一、实验材料

主要试剂及仪器

二、实验步骤

1. 细胞交联：

a. 用1ml PBS重悬细胞；

b. 加28ul 37%甲醛（终浓度为1%）进行交联，室温翻转孵育10min；

c.加入10×甘氨酸至终浓度为1×；室温翻转孵育5min，终止交联；

d. 4℃，3000g，离心3min；弃上清液；

e.  用1ml预冷的1X

PBS重悬细胞，用3000g，4℃，5min离心，去上清。

f． 重复e步骤一遍（此步骤沉淀可冻存于-80℃）；

2. 胞核制备和染色质碎裂：

a. 用200ul Membrane

Extraction Buffer(使用前加入2ul蛋白酶/磷酸酶抑制剂)重悬细胞；冰上静置10min；

b.4℃，3000g，离心3min；弃上清液；

c. 用200ul MNase Digestion

Buffer （使用前加入0.2ul DTT）重悬细胞核;

d. 加入0.2ul MNase ,吹打混匀；37℃水浴30min，期间5min混匀一次；

e. 加入20μL MNase Stop Solution；混匀后冰上放置5min;

f. 4℃，9000g，离心5min；弃上清液；

g. 用100μL of 1X IP Dilution

Buffer（使用前加入1ul蛋白酶/磷酸酶抑制剂）重悬沉淀；

h. 冰上超声打断5次，每次2min。

i. 4℃,9000g离心5min;转移上清到新的EP管中

3. 免疫沉淀：

a. 取10ul上清作为input,-20℃冻存备用；

b. 取90ul上清加入410ul

X IP Dilution Buffer；阳性对照组加入10ul Anti-RNA Polymerase

II Antibody，IP组加入10ug目的抗体；阴性对照组加入2μL

IgG 。

c. 样本管放到翻转仪4℃翻转过夜孵育；

d. 震荡混匀Protein A/G磁珠，并取20ul到每个实验组中；

e. 将样品置于磁力架上，静置2min进行磁性分离，弃上清；

f. 加入1ml IP Wash Buffer 1，并吹打混匀；置于翻转仪上，洗涤5min；

g．将样品置于磁力架上，静置2min进行磁性分离，弃上清；

h. 重复步骤f~g 3次；

i. 加入1ml IP Wash Buffer 2，并吹打混匀；置于翻转仪上，洗涤5min；

j. 将样品置于磁力架上，静置2min进行磁性分离，弃上清；

4. 洗脱：

a.加入150ul 1X IP Elution Buffer重悬磁珠，37℃震荡孵育30min；

b.将样品置于磁力架上，静置2min进行磁性分离，将上清转移到一个新的EP管中；

c. input样本中加入150ul 1X IP Elution Buffer；

d.各样本中分别加入6μL  NaCl(5M)、2μL 蛋白酶K(20mg/Ml);

e. 65℃孵育2h;

f. 使用 DNA 纯化离心柱从样品中纯化DNA。

g. 纯化的DNA冻存于-20℃；用于qPCR验证或测序；

5. qPCR检测:

a. 将Mix在4℃下融解，轻柔地上下颠倒混匀并进行短暂离心；

b. 冰上配制下表中的反应液：

成分加入量终浓度

HieffTM qPCR  SYBR® Green Master Mix (low Rox)5μL1×

Forward Primer(10μM)0.2μL0.2 μM

Reverse Primer(10μM)0.2μL0.2 μM

DNA2μL 

RNase-free  Waterto 10μL 

c. 将反应管进行短暂离心，确保所有反应液在反应孔底部。

d. 采用三步法程序进行反应：

循环数步骤温度时间荧光采集

1预变性95℃5minNo

40变性95℃10sNo

退火60℃30sYes

上述反应结束后，从60℃～95℃过程中进行熔解曲线分析

6.实验结果：

a．CHIP-qPCR柱状图:

                                                         CHIP-阳性质控

                                                         CHIP-qPCR

b.CHIP片段化图：

附件：

GAPDH promoter-FTACTAGCGGTTTTACGGGCG

GAPDH promoter-RTCGAACAGGAGGAGCAGAGAGCGA