侧根（LRs）是陆生植物根系统中的重要器官，对植物生长和发育至关重要。生长素是调控侧根发育的关键因子，几乎参与所有阶段的调控。生长素信号通过TIR1/AFBs受体、Aux/IAAs转录抑制因子和ARFs传递。除了经典的转录调控途径，生长素诱导的蛋白质磷酸化修饰也在信号传递和植物生长发育中发挥重要作用。
2024年7月山东大学丁兆军教授团队在Advanced Science（IF=14.3）杂志上发表题为“VIK-Mediated Auxin Signaling Regulates Lateral Root Development in Arabidopsis”文章。研究采用磷酸化修饰组学、LC-MS/MS质谱分析、CO-IP、酵母双杂和荧光素酶互补成像等技术，发现VIK介导的生长素信号转导分别通过增强LBD18的蛋白质稳定性和诱导ERF13的降解来调节侧根发育。拜谱生物为该研究提供了磷酸化修饰组学、LC-MS/MS磷酸化位点分析技术服务。
英文标题：VIK-Mediated Auxin Signaling Regulates Lateral Root Development in Arabidopsis（Advanced Science，IF=14.3，2024.07）
中文标题：VIK介导的生长素信号调节拟南芥侧根发育
客户单位：山东大学
研究材料：拟南芥侧根
拜谱提供技术：磷酸化修饰组学、LC-MS/MS磷酸化位点分析
研究思路：
PART 01 研究结果
01、生长素促进VIK的磷酸化及其转录
为了鉴定生长素触发的潜在磷酸化调控因子，作者对10日龄拟南芥幼苗根用10 µM 萘乙酸（NAA）处理15分钟和8小时后进行磷酸化蛋白质组分析，结果发现VIK可能通过磷酸化修饰在介导生长素信号传递中发挥关键作用（图1A）。
图1 生长素促进VIK的磷酸化及其转录
(图源：Shang E,Wei K,Lv B, et al. Adv Sci (Weinh). 2024)
为了验证上述结果，作者在大肠杆菌中表达了带有6个组氨酸标签的重组VIK蛋白（His-VIK），并在细胞自由蛋白系统中进行了磷酸化实验。发现His-VIK随着时间的推移磷酸化水平略有增加。在野生型拟南芥幼苗的根组织裂解液中，NAA处理15分钟和30分钟后，His-VIK的磷酸化水平显著增加，表明生长素能显著促进VIK的磷酸化（图1B）。
通过酵母双杂交分析（Y2H）和烟草叶片中的荧光素酶互补成像实验（LCI）证实了VIK与TMK1之间存在直接相互作用，并且体外磷酸化实验表明TMK1可以磷酸化VIK。通过生成ProVIK:VIK-GFP转基因系进行的蛋白降解实验显示生长素可能不影响VIK蛋白的稳定性（图1C）。实时定量PCR分析发现，生长素处理能时间依赖性地诱导VIK转录水平的增加（图1D），且这种诱导主要通过ARF7/19依赖性方式实现，在arf7/19突变体中VIK表达的诱导明显减弱，而在lbd16/18/33突变体中VIK表达仍能被生长素显著诱导。
02、VIK 介导的叶绿素信号积极调控 LR 发育
通过分析两个VIK T-DNA插入突变体（vik-2和vik-3），发现与野生型相比，突变体的LR密度、LR原基（LRP）和已发育的LR显著减少，尤其是vik-2（图2）。相反，过表达VIK的转基因植株表现出LR密度增加。此外，在vik-2突变体背景下表达VIK的转基因植株恢复了LR发育缺陷。生长素处理实验表明，vik-2突变体对生长素诱导的LR发育反应减弱，表明VIK在生长素调控LR发育中发挥关键作用。
图2 VIK介导的生长素信号通路正向调控LR的发育
(图源：Shang E,Wei K,Lv B, et al. Adv Sci (Weinh). 2024)
03、VIK 与ERF13 进行物理交互
研究发现VIK在生长素诱导的侧根（LR）发育中扮演关键角色，因此推测ERF13可能是VIK的潜在底物。通过Y2H、LCI、双分子荧光互补 （BiFC）和免疫共沉淀实验（CO-IP），证实了VIK与ERF13之间存在直接的相互作用（图3）。这些结果表明VIK与ERF13在物理上相互作用，支持了ERF13可能是VIK作用底物的假设。
图3 VIK与ERF13相互作用
(图源：Shang E,Wei K,Lv B, et al. Adv Sci (Weinh). 2024)
04、VIK以正反馈的方式调控ERF13磷酸化
通过磷酸化蛋白组学分析，发现NAA处理可快速诱导ERF13磷酸化。体外实验表明，VIK具有自磷酸化活性，并可直接磷酸化ERF13的Ser168和Ser172位点（图4）。点突变发现显著降低了ERF13的磷酸化水平。此外，ERF13可增强VIK的自磷酸化，尤其是ERF13的磷酸模拟突变体。进一步实验表明，VIK可通过形成同源二聚体进行自磷酸化，但ERF13突变体不影响VIK二聚体的形成。总体而言，VIK通过反馈机制调控ERF13的磷酸化。
图4 VIK以正反馈方式磷酸化ERF13的Ser168和Ser172位点
(图源：Shang E,Wei K,Lv B, et al. Adv Sci (Weinh). 2024)
05、VIK介导的磷酸化促进ERF13降解
研究发现，VIK介导的磷酸化作用影响ERF13蛋白的稳定性，进而调控侧根发育。实验显示，ERF13蛋白在早期侧根原基中表达，随后在发育过程中消失，而VIK蛋白在所有侧根中持续表达（图5）。通过体外实验和体内实验，发现VIK能够促进ERF13的降解。进一步通过磷酸模拟和磷酸失活突变体的实验，证实了ERF13在Ser168和Ser172位点的磷酸化促进了其降解。此外，VIK与MPK14可能协同作用促进ERF13降解，但两者之间没有直接的相互作用。最后亚细胞定位分析表明，ERF132D和ERF132A均位于细胞核，且与WT无明显差异。qRT-PCR结果显示，vik-2突变体中ERF13 mRNA水平未显著变化，但其下游基因KCS8和KCS16显著降低，进一步证明VIK在蛋白水平上调控ERF13。总之，VIK介导的磷酸化通过负调控ERF13的稳定性，加速生长素诱导的ERF13降解。
图5 VIK 介导的磷酸化加速了ERF13降解
(图源：Shang E,Wei K,Lv B, et al. Adv Sci (Weinh). 2024)
06、VIK 介导的 ERF13 磷酸化调节 LR 的出现
研究进一步探讨了VIK调控的ERF13降解在侧根（LR）发育中的作用。通过比较不同转基因植物系的LR表型，发现过表达ERF13抑制了LR的出现，在vik突变体中这种抑制作用增强，而在过表达YFP-VIK的背景下这种抑制作用减弱（图6）。此外，比较ERF13的不同磷酸化模拟和磷酸失活变异体的过表达植物系，发现ERF132A-Myc（磷酸失活）的植物系LR出现更少，而ERF132D-Myc（磷酸化模拟）的植物系LR出现略多。这些结果表明，VIK介导的ERF13磷酸化和降解促进了LR的出现。
图6 VIK介导的ERF13磷酸化促进LR的出现
(图源：Shang E,Wei K,Lv B, et al. Adv Sci (Weinh). 2024)
07、VIK在侧根发育中磷酸化并稳定LBD18蛋白
通过分析两个VIK T-DNA插入突变体（vik-2和vik-3），发现与野生型相比，突变体的侧根（LR）密度、LR原基（LRP）和已发育的LR显著减少，尤其是vik-2（图7）。相反，过表达VIK的转基因植株表现出LR密度增加。此外，在vik-2突变体背景下表达VIK的转基因植株恢复了LR发育缺陷。生长素处理实验表明，vik-2突变体对生长素诱导的LR发育反应减弱，表明VIK在生长素调控LR发育中发挥关键作用。
图7 VIK 在LR形成过程中直接磷酸化和稳定LBD18蛋白
(图源：Shang E,Wei K,Lv B, et al. Adv Sci (Weinh). 2024)
PART 02 文章小结
生长素作为最重要的植物激素之一，在调控植物生长和发育过程中起着关键作用。这项研究通过磷酸化蛋白质组学分析筛选到快速响应生长素的蛋白激酶VIK，并证实VIK通过调控LBD18和ERF13来调控侧根的形成。一方面，生长素以ARF7/19依赖的方式诱导VIK的转录；另一方面，它通过TMK1激活VIK的激酶活性，激活的VIK可以磷酸化LBD18和ERF13。磷酸化的LBD18变得更加稳定，调节侧根的启动。然而，磷酸化的ERF13经历降解，缓解了其对侧根出现的抑制，从而促进侧根的形成（图8）。VIK的发现不仅丰富了我们对生长素信号传递机制的理解，而且为农业生产中通过调控生长素信号来提高作物产量和抗逆性提供了潜在的策略。
图8 VIK介导的生长素信号调节侧根形成
(图源：Shang E,Wei K,Lv B, et al. Adv Sci (Weinh). 2024)
PART 03 拜谱小结
研究采用磷酸化修饰组学、LC-MS/MS质谱分析、CO-IP、酵母双杂和荧光素酶互补成像等技术，发现 VIK 介导的生长素信号转导分别通过增强 LBD18 的蛋白质稳定性和诱导 ERF13 的降解来调节 LR 发育。拜谱生物作为一家国内领先的多组学服务公司，可提供完善成熟的蛋白质组学、修饰蛋白质组学、代谢组学、转录组学等多组学产品技术服务体系。拜谱特色磷酸化修饰产品—超高深度DIA·磷酸化修饰组，采用创新富集技术+Astral DIA，超高深度赋能低丰度磷酸化蛋白/位点发掘，单针最高可实现动物样本10w+、植物样本5w+磷酸化修饰位点检出，可广泛应用于植物、动物研究，绘制物种磷酸化修饰图谱，助力高分文章发表。此外，磷酸化修饰组学可与蛋白组学、代谢组学等多组学联合，整合多组学数据进行深入挖掘分析，全面解析机制机理等。欢迎咨询！
参考文献：
Shang E, Wei K, Lv B, Zhang X, Lin X, Ding Z, Leng J, Tian H, Ding Z. VIK-Mediated Auxin Signaling Regulates Lateral Root Development in Arabidopsis. Adv Sci (Weinh). 2024 Jul 3:e2402442. doi: 10.1002/advs.202402442. Epub ahead of print. PMID: 38958531.
