这篇文章简单来讲讲的是：驻留在脂肪组织中的巨噬细胞利用外泌体调节全身胰岛素反应。
文章亮点：
- 脂肪组织巨噬细胞(Adipose Tissue Macrophages, ATM)分泌的外泌体将miRNA转移到胰岛素靶细胞
- 用肥胖小鼠的ATM外泌体治疗瘦老鼠可引起胰岛素抵抗
- 用瘦小鼠ATM外泌体治疗肥胖小鼠可改善胰岛素抵抗
- 肥胖小鼠的ATM外泌体含有miR-155，可能是导致胰岛素抵抗的原因
【摘要】
miRNA是一种调节分子，可以被包装在外泌体中从细胞中分泌出去。这里，我们展示了肥胖小鼠脂肪组织巨噬细胞分泌的含有miRNA的外泌体(Exos)给瘦小鼠使用时，可导致瘦小鼠发生葡萄糖耐受不良和胰岛素抵抗。相反，从瘦老鼠身上获得的ATM Exos，注射给肥胖小鼠，可改善肥胖小鼠的葡萄糖耐量和胰岛素敏感性。miR-155是肥胖小鼠ATM Exos中高表达的miRNA之一，更早的研究表明PPAR是miR-155的靶基因。我们的结果表明，与对照组相比，敲除miR-155的小鼠具有胰岛素敏感性和葡萄糖耐受性。此外，将野生型小鼠的骨髓移植到miR-155敲除小鼠中可以缓和这种表型。综上所述，我们的研究表明ATM Exos中含有miRNA。这些miRNAs可以通过旁分泌或内分泌调节机制被转移到胰岛素靶细胞，对细胞胰岛素反应、胰岛素敏感性和整体葡萄糖稳态具有强大的影响。
引言
胰岛素抵抗是2型糖尿病的重要病因，肥胖人类胰岛素抵抗最常见的原因。由于全球肥胖率的持续上升，2型糖尿病的患病率也随之上升。人类和啮齿类动物肥胖的特征之一是脂肪组织、肝脏、可能还有骨骼肌的慢性未解决的炎症。这种由肥胖引起的组织炎症反应其中一个引人注目的组成部分是促炎巨噬细胞的积聚，尤其是在脂肪组织和肝脏中。许多早期的研究检测了这种慢性组织炎症状态，并提出促炎细胞因子，如肿瘤坏死因子(TNF-a)，是由组织巨噬细胞分泌的，可直接抑制胰岛素敏感性，是肥胖诱导的胰岛素抵抗的一个潜在病因。然而，抗TNF-a抗体在人类胰岛素抵抗和葡萄糖代谢方面的治疗疗效不显著，提示有其他巨噬细胞分泌因子和免疫细胞因子参与了胰岛素抵抗。最近，花生四烯酸衍生的二十碳三烯白三烯B4通过其特异性受体BLT1发挥作用，被认为是直接降低肝细胞和肌细胞胰岛素信号通路的因素之一。Galectin-3是另一种巨噬细胞分泌因子，既可促进促炎反应，又可通过抑制胰岛素受体信号通路直接阻断胰岛素作用。在这篇文章中，我们报道了ATMs通过分泌含有miRNA的Exos进入循环系统来调节胰岛素作用的新机制。
miRNA与mRNA的结合导致靶mRNA被募集到RNA诱导的沉默复合物(RISC)中，从而导致转录停滞和mRNA的降解。除了这种本身的细胞内作用，miRNA可以以外泌体内含物的形式被细胞分泌出去，既可以在局部发挥作用，也可以进入血液循环，在远端发挥作用。也有证据表明，这些Exos可以被运输到邻近或遥远的受体细胞，调节受体细胞的功能。这些现象导致我们假设ATMs可分泌外泌体miRNA，作为细胞外分子调节细胞胰岛素作用和系统胰岛素敏感性。
结果
1. ATMs分泌外泌体miRNA
文章第一步先确定ATMs可以分泌包含miRNA的外泌体。
(B)肥胖脂肪组织巨噬细胞(ATMs)分泌Exos的电镜分析。标尺，200纳米。
(C)通过NanoSight分析测量肥胖小鼠ATMs分泌的囊泡的颗粒大小。
(D)Western Blot检测外泌体(Exo)特异性标志物TSG101、syntenin 1及胞外囊泡相关蛋白标志物HSP70、CD63、CD9。这些印迹代表3个重复的独立实验，每个包含2个样本。
(E)肥胖ATMs的Exos用PKH26标记，然后加入到3T3-L1脂肪细胞培养中。
(F)EV分泌抑制剂GW4689(10μM)对3T3-L1受体细胞表达ATMs外泌体依赖性miRNA的影响。
数据以均数±SEM表示。n = 4每组(A和E；n = 3 (C)。p < 0.05， *p < 0.01，Student’s t test。
2. 从肥胖小鼠中提取的含miRNA的Exos促进胰岛素抵抗
从肥胖小鼠中提取的含miRNA的Exos会损害三种主要胰岛素靶组织的胰岛素敏感性。
(C - F)葡萄糖输注率(GIR) (C)、胰岛素刺激葡萄糖处理率(IS-GDR)(骨骼肌胰岛素敏感性指标) (D)、肝脏葡萄糖产生率(HGP) (E)、高胰岛素-降血糖钳位研究中游离脂肪酸水平抑制(FFA抑制)(F)的百分比。
(G - I)通过Western Blot检测胰岛素注射后骨骼肌(G)、肝脏(H)和VAT (I)中S473位点的AKT磷酸化水平。这些印迹代表3个重复的独立实验，每个包含2个样本。这个结果为了表明胰岛素信号在这些组织中减少。
*Data are presented as mean ± SEM. n = 7 mice for NCD control group (A–F) and n = 8 mice for the other groups. p < 0.05, 1-way ANOVA with Bonferroni’s post-test (A and B) or Student’s t test (C–F).
3. 肥胖小鼠ATM-Exosomal miRNAs损害细胞的胰岛素敏感性
肥胖ATM-Exos在体内的作用显著，我们同时对脂肪细胞、肌细胞和肝细胞的进行了相应的体外研究。
(D - F)肥胖ATM-Exos处理后，AKT磷酸化水平在3T3-L1脂肪细胞、L6肌肉细胞和原代肝细胞中的变化。这些印迹代表3次重复实验，每次包含2个样本。
(G)在siRNA诱导的Drosha (M1 ExossiRNA-Drosha)敲除后，从LPS诱导的M1 BMDMs中收集Exos，然后加入3T3-L1脂肪细胞培养。24小时后测量脂肪细胞对葡萄糖的吸收。
这些结果表明，miRNAs与巨噬细胞来源Exos可调节胰岛素敏感性能力有关。
4. 来自瘦小鼠的ATM-Exos会降低肥胖引起的胰岛素抵抗
从反面去验证上面实验得到的结果。
(C - F)葡萄糖输注率(GIR) (C)、胰岛素刺激葡萄糖处理率(IS-GDR)(骨骼肌胰岛素敏感性指标) (D)、肝脏葡萄糖产生率(HGP) (E)、高胰岛素-降血糖钳位研究中游离脂肪酸水平抑制(FFA抑制)(F)的百分比。
(G和H)瘦ATM-Exos对3T3-L1脂肪细胞和L6肌细胞葡萄糖摄取的影响。
这些结果表明，在瘦ATM-Exos对肥胖诱导的胰岛素抵抗具有保护作用。
5. 肥胖诱导ATM-Exo中miRNA的表达变化
现在开始做机制。
(B)瘦ATMs和肥胖ATMs中miR-155的表达水平。
(C)瘦ATMs和胖ATMs分泌的Exos中MiR-155的丰度。
(D - F)经过24小时的瘦ATM-Exo与胖ATM-Exos处理后，通过qPCR检测脂肪细胞(D)、L6肌细胞(E)和原代肝细胞(F)中miR-155的水平。数据归一化至U6(细胞)或Exos总蛋白水平。
6. MiR-155损害细胞胰岛素信号通路
上一个结果中列举了MiR-155表达的趋势，现在开始做表达差异的功能。
(D)过表达miR-155后，Western Blot检测其靶基因PPAR在3T3-L1脂肪细胞、L6细胞和原代肝细胞中的表达。同时也检测了PPAR的靶基因GLUT4在3T3-L1脂肪细胞和L6细胞中的表达。Western Blot检测3T3-L1脂肪细胞、L6肌细胞和原代肝细胞中PPAR的暴露时间分别为100 s、480 s和440 s。在3T3-L1脂肪细胞和L6肌细胞中检测GLUT4的暴露时间分别是80秒和60秒。3次重复实验，每次包含3个样本。
(E)过表达miR-155后，受体细胞中与argonaut蛋白结合的PPAR mRNA的表达丰度。
(F)罗格列酮(Rosi)(PPAR激动剂)可恢复过表达miR-155对3T3-L1脂肪细胞和L6肌肉细胞葡萄糖摄取的影响。
7. ATM-Exo miR-155促进肥胖诱导的胰岛素抵抗
miR-155抑制细胞胰岛素信号转导。
(C和D)在骨髓移植后HFD喂养20周，对miR-155KO受体小鼠进行GTTs和ITTs。
(E)通过qPCR分析miR-155KO受体小鼠原代脂肪细胞和肝细胞中MiR-155的丰度。
(F)在骨髓移植后miR-155KO受体小鼠的原代脂肪细胞和肝细胞中检测miR-155靶基因PPAR丰度。在原代脂肪细胞中也检测到了GLUT4的表达。Western Blot检测原代脂肪细胞和肝细胞中PPAR的检测时间分别为120 s和550 s。检测GLUT4蛋白条带的暴露时间为150 s。3次重复实验，每次实验包含3个样本。
(G和H)测定骨髓移植后原代脂肪细胞的葡萄糖摄取和原代肝细胞的葡萄糖产量。
数据以均数±SEM表示。n = 10只小鼠每组(A-E)和n = 10每组(G-H)。p < 0.05, 的单因素方差分析和Bonferroni’s post-test (A-D) 或Student’s t test(G和H)。*
这篇文章先是确定了表型：ATMs可以分泌外泌体，这些外泌体会与胰岛素抵抗相关，胖ATM-Exo会促进胰岛素抵抗，瘦ATM-Exo可以降低肥胖引起的胰岛素抵抗。
然后去探讨为何ATM-Exo可以发挥这样的作用。发现ATM-Exo包含miRNA，瘦ATM-Exo与胖ATM-Exo中miRNA的表达差异显著，肥ATM-Exos中miR-155的丰度明显高于瘦ATM-Exos。选择这个miRNA主要是根据研究经验（也有可能是课题组刚好有这种转基因小鼠）。然后选了miR-155众多靶基因中的一个和胰岛素信号通路相关的靶基因PPAR，同理选了GLUT4。
最后从正、反、在体、离体等多个角度去show了一些支持猜想的结果。
这篇文章思路简洁，逻辑连贯，但是在过渡到选择靶分子的这一步没有必须性。按照这个差异表达结果其实可以选择那些差异表达的另外某个miRNA去做，说不定也可以做出来相似的结果。
这篇文章的方法部分可以借鉴一些ATMs分离，外泌体分离提纯的方法，还有transwell共培养，骨髓移植等技术之前没接触过，需要按需学习。
如果你关注了我，希望你与我一起学习，一起成长！❤
