A genomewide transcriptomic approach identifies a novel gene expression signature for the detection of lymph node metastasis in patients with early stage gastric cancer
全基因组转录组学方法确定了检测早期胃癌患者淋巴结转移的新基因表达特征
发表期刊：EBioMedicine
发表日期：2019 Mar
DOI: 10.1016/j.ebiom.2019.01.057
一、背景
淋巴结转移（LN）是影响胃癌（GC）患者预后不佳的主要因素之一。因此，在治疗前准确识别LN状态，特别是在早期阶段（粘膜和粘膜下），是改善患者的治疗策略和生存结果的关键。
近几十年来，一些基于基因表达的分类器已经被开发出来，作为诊断和预测工具用于各种类型的癌症。例如，Oncotype DX是一种商业化的测试，包括对预测乳腺癌和结直肠癌复发风险的一组基因的分析。类似的基于基因表达的预后和预测分类法也被开发出来用于GC患者；然而，它们的临床作用有限。
二、材料与方法
1.数据来源
1）TCGA数据：RNA-seq数据测量了20531个基因的表达水平，并在基因水平RSEM文件中进行了比例估计，这些基因通过乘以10转换为TPM（每百万的转录本）6，然后对 log2 进行转换。ACRG （GSE62254）数据集是使用R中的生物导体包“GEOquery”直接从GEO数据库以处理形式从GEO数据库下载的。
2）为了进行临床验证，检查了来自两个独立的T1和T2早期GCs患者队列的248个组织标本，它们被称为临床队列-1（测试队列）和临床队列-2（验证队列）；包括来自LN阳性（LNP）和LN阴性（LNN）患者的50份和198份未经预处理的标本。
由于GC诊断和治疗决策主要在内镜切除后决定，考虑到在内镜检查期间这些病变可能被低估，还纳入了T2病变。在对手术组织进行病理学复查后诊断淋巴血管浸润，并从各参与机构收集血清癌胚抗原（CEA）和癌症抗原（CA）19-9水平的数据。
2.实验流程
1）生物标志物发现：基于TCGA数据集中T1患者标本的RNA-Seq数据对5个LNP和13个LNN GC患者之间差异表达的15个基因进行了优先排序；用这15个基因作为协变量建立了一个多变量逻辑回归模型；数据验证。
2）临床验证：分析了两个大型的独立患者队列，以验证在发现阶段确定的15个基因特征
3）RNA分离和定量反转录PCR
4）统计学分析：Wilcoxon's signed-rank检验、Mann-Whitney U检验和Kruskal-Wallis检验；从15个基因的多变量逻辑回归模型中得出的风险分数被用来绘制接受操作特征（ROC）曲线并计算曲线下的面积（AUCs）
三、实验结果
01、在全基因组范围内发现检测早期胃癌淋巴结转移的新型基因表达特征
为了确定能够帮助诊断淋巴结转移患者的基因，作者首先分析了18名早期T1癌症患者的RNA-seq表达谱数据，这些患者的LN转移阳性或阴性。在总共20531个基因中，有84个基因在5个淋巴结阳性（LNP）和13个阴性（LNN）患者之间存在差异表达（图1a）。为了确定一个强大的候选基因特征，通过过滤低表达的基因，将基因列表进一步缩小到15个。使用多元Logistic回归分析，发现这15个候选基因能够成功区分训练集中的LNP和LNN GC患者（AUC = 1.000，图1b）。
鉴于有多个由T2 GC患者组成的公共数据集，作者接下来研究了T1淋巴结转移GC基因特征是否也能在这些额外的患者群中识别LN状态。在TCGA队列的96名T1和T2患者的扩大集合（AUC =0.839，图1c），以及在188名T2患者的ACRG队列中（AUC =0.829，图1d）中，基因能够区分LNP和LNN患者。这些数据突出了新型15基因在识别早期胃癌患者LN转移中的诊断潜力。
02、验证和建立用于检测胃癌患者淋巴结状态的15个基因特征
接下来，通过qRT-PCR对临床队列-1（n = 101）中的24个LNP和77个LNN组织标本评估了15个基因组合的诊断准确性。虽然单个基因的预测能力有限，但各种基因的组合在识别GC患者的LN转移方面表现出明显的检测能力。利用多元Logistic回归分析，得到了15个基因特征的风险评分公式如下，风险评分=1.300-（0.233 × C5AR1）-（0.274× CD83）+（0.048 × ETV4）-（0.213 × FAM13A）+（0. 207 × FKBP10）-（0.227× GPRIN3）+（0.052 × LCK）+（0.124 × NR4A2）+（0.402 × PRSS21）+（0.035× RGPD1）-（0.196 × SLC2A3）-（0.212 × SLFN2）+（0.174 × TEM86B）-（0.118× TRPV4）-（0.075 × YBX2）。尽管每个单独的基因的性能并不明显，但在这个测试队列中，使用这个公式为患者确定的LN转移的风险分数显示了强大的诊断性能（AUC = 0.765，图2a）。
值得注意的是，在识别LNP患者方面，15个基因特征与传统的肿瘤标志物CEA和CA19-9（图2b）相比有明显优势。为了进一步验证这15个基因特征的诊断效率，作者接下来使用多元Logistic回归分析，在一个由26名LNP和121名LNN T1 GC患者组成的独立验证队列中检查其性能。与测试队列的结果一致，15个基因特征再次能够有力地区分LNP和LNN早期GC患者（AUC=0.742，图2b）。
03、15个基因签名在胃癌患者的LN转移检测中表现优于传统的诊断方法
通过多变量分析，作者证明了15个基因特征能够成功地检测出LN转移，而不受术前临床因素如年龄、性别、肿瘤标志物和计算机断层扫描确定的临床LN状态影响（Table 3）。为了进一步评估这一特征的意义，接下来比较了15-基因特征与各种术前临床因素（包括肿瘤标志物和临床LN状态）的诊断潜力。发现15-基因特征的诊断价值明显优于传统的肿瘤标志物，包括循环CEA水平和CA19-9（图2b）。
此外，为了评估15-基因特征的性能，作者将其性能与验证队列中的患者术前诊断性CT扫描确定的临床N期进行了比较。与CT成像数据相比，基因表达特征在识别LN转移的存在方面表现出明显优越的准确性（AUC = 0.742，图2c），后者的AUC仅为0.595。
04、15个基因特征与其他临床病理特征相结合，进一步提高了胃癌患者LN转移检测的诊断准确性
接下来探索将15-基因特征与目前使用的临床病理因素（如年龄、性别、肿瘤标志物和使用多变量逻辑回归分析的临床N期）结合起来，是否会进一步提高诊断准确性。与单独使用15-基因特征相比，将基因表达特征与临床N期相结合，确实显著提高了生物标志物在识别LNP胃癌病例方面的鉴别准确性（AUC=0.789）（图2d）。
四、结论
作者开发了一个新的15-基因特征，有可能用于识别早期GC患者的LN转移。在前瞻性临床队列中得到进一步验证之前，这些标志物为识别胃癌患者的LN转移提供了很好的潜力。
