kggseq软件是一款功能强大的测序后下游分析软件，现简要列举其功能如下，以备查询。
1. 质控（Quality Control）
-
对基因型的质控（Genotype QC）
参数如下：
-
对位点的质控（Variant QC）
参数如下：
image.png
image.png - 对样本的质控（Sample QC）
可以使用kggseq软件把vcf转换为plink格式进行质控，包括 (pairwise relatedness, mendel error rate and sex check)
java -jar kggseq.jar --vcf-file path-to-file1 --ped-file path/to/file2 <Variants and Genotype QC Settings> --db-merge <Reference genotype set> --o-plink-bed
plink --bfile kggseq.merged --genome
plink --bfile kggseq --mendel
plink --bfile kggseq --check-sex
- 也可以画MAF分布图
java -jar kggseq.jar --vcf-file path-to-file1 --out path/to/prefixname --mafplot
java -jar kggseq.jar --vcf-file path-to-file1 --ped-file path/to/file2 --db-filter hg18_dbsnp138,hg18_dbsnp141 --allele-freq 0,0.01 --o-vcf path/to/file3
2. 过滤（Filtering）
-
使用--genotype-filter参数，后面加上数字，数字对应意义如下：
image.png
- 使用--double-hit-gene-trio-filter 或 --double-hit-gene-phased-filter参数提取复合杂合或者隐形突变位点
java -jar ./kggseq.jar --buildver hg19 --vcf-file path/to/file1 --ped-file path/to/file2 --db-gene refgene --gene-feature-in 0,1,2,3,4,5,6 --db-filter 1kg201204,dbsnp137,ESP6500AA,ESP6500EA --rare-allele-freq 0.033 --db-score dbnsfp --mendel-causing-predict best --double-hit-gene-trio-filter (OR --double-hit-gene-phased-filter)
- 使用基因特征过滤（Gene feature filtering）
参数：--db-gene & --gene-feature-in （两个参数分别选择数据库和基因特征）
java -jar ./kggseq.jar --buildver hg19 --vcf-file path/to/file1 --ped-file path/to/file2 --dgv-cnv-annot --splicing 6 --db-gene refgene,gencode,knowngene --gene-feature-in 0,1,2,3,4,5,6
基因特征代号如下：
image.png
- 使用公共数据库的基因型频率进行过滤（--db-filter）
java -jar ./kggseq.jar --buildver hg19 --vcf-file path/to/file1 --ped-file path/to/file2 --db-filter 1kg201204,dbsnp141,ESP6500AA,ESP6500EA --rare-allele-freq 0.005 --db-filter-hard dbsnp138nf
也可以对本地数据进行频率过滤（--local-filter-hard）
- 过滤掉重复区域（--superdup-filter）或者注释这些区域（--superdup-annot）
java -jar ./kggseq.jar --buildver hg19 --vcf-file path/to/file1 --ped-file path/to/file2 --superdup-filter
- 过滤掉indel，某些基因或某些区域
- --ignore-indel
- --ignore-snv
- --genes-out
- --regions-out
- 过滤掉假基因等其他因素造成的变异位点过多的基因（--gene-var-filter）
java -jar ./kggseq.jar --buildver hg19 --vcf-file path/to/file1 --ped-file path/to/file2 [options to filter out common and neutral variants] --gene-var-filter 4
- 过滤掉实验组/对照组独有的位点（--filter-model case-unique or --filter-model control-unique）
java -jar ./kggseq.jar --buildver hg19 --vcf-file path/to/file1 --ped-file path/to/file2 --filter-model case-unique
3. 注释（Annotation）
- 能注释的信息包括：
- SNP rs号（--rsid）
- 选择性剪切位点（--scsnv-annot）
- 该位点是否位于CNV区域（--dgv-cnv-annot）
- 该位点是否与感兴趣的基因在同一蛋白通路上（--candi-list gene1,gene2,...,geneN --ppi-annot ppiDatabase ）
- 该位点是否与感兴趣的基因在同一基因通路上（--candi-list gene1,gene2,...,geneN --geneset-annot GenesetDatabase ）
- 该位点最近的基因对应的小鼠表型（--mouse-pheno）
- 该位点最近的基因对应的斑马鱼表型（--zebrafish-pheno）
- 该位点最近的基因对应的疾病表型（--ddd-annot）
- 该位点最近的基因在pubmed数据库中的相关文献（--phenotype-term searchTerm and --pubmed-mining）
java -jar kggseq.jar --vcf-file path/to/file1 --ped-file path/to/file2 --phenotype-term search+Term1,search+Term2 --pubmed-mining
PubMedIDIdeogram : PubMed ID of articles in which the term and the cytogeneic position of the variant are co-mentioned
PubMedIDGene : PubMed ID of articles in which the term and the gene containing the variant are co-mentioned
- 该位点对应基因在OMIM数据库中的疾病术语（ --omim-annot）
- 该位点在COSMIC数据库中的注释信息（--cosmic-annot）
4. 位点功能的预测（Prediction at variant）
主要包括数据库：i.e., SIFT, PolyPhen2, GWAVA and CADD
- 预测孟德尔疾病致病位点（--db-score dbnsfp --mendel-causing-predict）
java -jar kggseq.jar --vcf-file path/to/file1 --ped-file path/to/file2 --db-score dbnsfp --mendel-causing-predict best --filter-nondisease-variant
该方法通过对位点进行逻辑回归建模，评估前10个AUC曲线来确定候选位点。
也可以指定数据库进行打分预测（--mendel-causing-predict 4,6,7）
- 预测癌症中的高频体细胞突变（--db-score dbnsfp --cancer-mut-predict）
- 预测复杂疾病的致病位点
- 对非编码位点使用10个数据库进行打分预测（--db-score dbncfp_known [or dbncfp_all] --regulatory-causing-predict ）
10个数据库包括：SuRFR、GWAS3D、FunSeq2、FATHMM-MKL、FunSeq、DANN、CADD_CScore、 GWAVA_Unmatched、GWAVA_TSS、GWAVA_Region。 - 通过添加细胞类型特异性调控甲基化分子标记预测致病基因（--db-score dbncfp_known [or dbncfp_all] --regulatory-causing-predict all --cell）
- 数据库资源包括（1）16 ENCODE cell types，默认采用GM12878细胞系。
（2）127 RoadMap human reference epigenomes ，默认采用E116 （GM12878 Lymphoblastoid Cell Line）
java -jar kggseq.jar --vcf-file path/to/file1 --db-score dbncfp_known --regulatory-causing-predict all --cell GM12878
java -jar kggseq.jar --vcf-file path/to/file1 --db-score dbncfp_known --regulatory-causing-predict all --cell E116
- 基因特征特异性模型（--db-score dbncfp_known [or dbncfp_all] --ldgf-func-predict）
用10个数据库的打分预测非编码区位点的致病情况
5. 针对基因的预测（Prediction at gene）
- 基因的致病性预测（--patho-gene-predict）
通过对Clinical Genomic Database数据库的打分，得到基因的致病打分。
java -jar kggseq.jar --vcf-file path/to/file1 --ped-file path/to/file2 --out path/to/prefixname --excel --db-gene refgene --patho-gene-predict
- 表型挖掘（--phenotype-term searchTerm and --phenolyzer-prediction）
通过使用phenolyzer工具对表型相关基因进行排序，寻找到候选基因。
java -jar kggseq.jar --vcf-file path/to/file1 --ped-file path/to/file2 --out path/to/prefixname --excel --db-gene refgene --phenotype-term searchTerm1,searchTerm2 --phenolyzer-prediction
- 组织特异性表达（--tissue-spec-annot）
使用GTEx数据库注释基因的表达情况。
java -jar kggseq.jar --vcf-file path/to/file1 --ped-file path/to/file2 --out path/to/prefixname --excel --db-gene refgene --tissue-spec-annot
6. 统计检验
- 癌症驱动基因的负荷检验-ITER或者WITER或者WITER-ref方法（--iter-gene-coding）
java -jar witer.jar --maf-file path/to/file1.maf --out path/to/prefixname [other tags] --iter-gene-coding
java -jar witer.jar --maf-file path/to/file1.maf --out path/to/prefixname [other tags] --witer-gene-coding
java -jar witer.jar --maf-file path/to/file1.maf --out path/to/prefixname [other tags] --witer-gene-coding --ref-mut-file path/to/referenceDataset --cancer-label XXX
- 复杂疾病易感基因罕见突变位点负荷检验RUNER方法（--runer-gene-coding）
java -jar witer.jar --nt 6 [or more threads] --vcf-file path/to/file1 --ped-file path/to/file2 \
--out path/to/prefixname [or other tags] --excel --qqplot --gty-qual 20.0 --gty-sec-pl 20 --gty-dp 8 --gty-af-ref 0.05 \
--gty-af-het 0.25 --gty-af-alt 0.75 --ignore-indel --vcf-filter-in PASS --min-obs-rate 0.9 --hwe-all 0.001 \
--max-allele 3 --db-gene refgene,gencode --db-filter gadexome.[an ancestry tag],gadgenome.[an ancestry tag],1kgeas201305 \
--rare-allele-freq 0.01 --gene-freq-score [an ancestry tag] \
--db-score dbnsfp --disease-causing-predict best --runer-gene-coding
- 也可以选择编码区等位点进行分析（ --response-gene-feature 2,3,4,5,6）
- 负荷检验后可以挖掘最相关的文献（--phenotype-term [disease name] --pubmed-mining-top-gene 10）
- 不将位点功能打分加入负荷检验模型（--uwruner-gene-coding）
- 使用本地control样本的频率进行检验（--gene-freq-score CONTROL）
- 加入其它协变量进行检验（ --gene-cov-file）,如：
Gene score1 score1 ...
SAMD11 2.114 0.076914032 ...
NOC2L 2.345 0.046528595 ...
KLHL17 1.989 0.026329064 ...
PLEKHN1 2.2 0.047853652 ...
... ... ... ...
7. 对位点的关联分析
- 卡方检验（--var-assoc）
java -jar ./kggseq.jar --buildver hg19 --var-assoc --p-value-cutoff 0.01 --multiple-testing benfdr --qqplot
- 使用 Rvtests软件的score, wald, exact, dominantExact, famLRT, famScore, famGrammarGamma 和 firth models等模型进行检验（ --rvtest-var）
java -jar ./kggseq.jar --rvtest-var score,wald,exact,... --rvtest-vcf --rvtest-remove-set \
--vcf-file path/to/vcf/file --ped-file path/to/pedigree/file --phe phenotypeName \
--cov covariateName1,covariateName2,...,covariateNameN \
--out path/to/prefixname --excel --db-gene refgene
8. 对基因的关联分析
- 使用SKAT软件以基因为单位进行检验（--skat-gene）
包括SKAT,SKATO 和 Burden test算法。
java -jar ./kggseq.jar --skat-gene --vcf-file path/to/vcf/file --ped-file path/to/pedigree/file \
--phe phenotypeName --cov covariateName1,covariateName2,...,covariateNameN \
--out path/to/prefixname --excel \
--db-gene refgene [--p-value-cutoff 0.01 --multiple-testing benfdr --qqplot]
- 使用Rvtests（--rvtest-gene）软件进行检验
java -jar ./kggseq.jar --rvtest-gene cmc,cmat,price,skat[nPerm=1000:alpha=0.001:beta1=1:beta2=20],... --rvtest-vcf \
--rvtest-remove-set --vcf-file path/to/vcf/file --ped-file path/to/pedigree/file --phe phenotypeName \
--cov covariateName1,covariateName2,...,covariateNameN \
--out path/to/prefixname --excel --db-gene refgene
- 使用SKAT软件进行基因通路分析（--skat-geneset）
java -jar ./kggseq.jar --skat-geneset --geneset-file path/to/geneset/file --vcf-file path/to/vcf/file \
--ped-file path/to/pedigree/file --phe phenotypeName \
--cov covariateName1,covariateName2,...,covariateNameN \
--out path/to/prefixname --excel \
--db-gene refgene [--p-value-cutoff 0.01 --multiple-testing benfdr --qqplot]
基因通路需要存放在一个txt文件中，格式如下：
注：如果报错，可能是因为文件后面有空行，请用 --lib-update命令更新KGGSeq到最新版，或直接删除空行即可。
[Column 1: GeneSet ID]
[Column 2: GeneSet URL]
[Column 3..N: Gene Symbols in the geneset; separated by spaces].
No title row is required!!!
e.g.,
----------------------------------------------
KEGG_GLYCOLYSIS_GLUCONEOGENESIS http://www.broadinstitute.org/KEGG_GLYCOLYSIS_GLUCONEOGENESIS.html LDHC LDHB LDHA
KEGG_CITRATE_CYCLE_TCA_CYCLE http://www.broadinstitute.org/KEGG_CITRATE_CYCLE_TCA_CYCLE.html GJB1 OGDHL OGDH PDHB IDH3G LDHB
...
...
- 使用RVTEST软件进行基因通路分析（--rvtest-geneset）
最新版的 kggseq增加了参数--rvtest-min-var 2 可以去除位点小于2的基因。
java -jar ./kggseq.jar --rvtest-geneset cmc,skato[nPerm=1000:alpha=0.001:beta1=1:beta2=20],... --rvtest-vcf \
--rvtest-remove-set --geneset-file path/to/geneset/file --vcf-file path/to/vcf/file \
--ped-file path/to/pedigree/file --phe phenotypeName --cov covariateName1,covariateName2,...,covariateNameN \
--out path/to/prefixname --excel \
--db-gene refgene [--p-value-cutoff 0.01 --multiple-testing benfdr --qqplot]
- 基因富集分析（--geneset-enrichment-test）
查看给定的基因是否在某些给定的基因通路上排在前列
java -jar kggseq.jar --vcf-file path/to/file1 --ped-file path/to/file2 --out path/to/prefixname [other tags] --geneset-enrichment-test
java -jar kggseq.jar --vcf-file path/to/file1 --ped-file path/to/file2 --out path/to/prefixname --db-filter 1kg201204,dbsnp137,ESP6500AA,ESP6500EA --rare-allele-freq 0.01 --db-gene refgene --gene-mutation-rate-test --geneset-enrichment-test --geneset-db <GenesetDatabase>
可以自己设定通路基因（--geneset-file path/to/geneset/file）
9. 简单的画图功能
- MAF柱形图（reference dataset --mafplot-ref or in sample --mafplot-sample）
java -jar kggseq.jar --vcf-file path/to/file1 --ped-file path/to/file2 --out path/to/prefixname --db-filter 1kg201204,dbsnp141,ESP6500AA,ESP6500EA --allele-freq 0,1 --mafplot-ref
java -jar kggseq.jar --vcf-file path/to/file1 --ped-file path/to/file2 --out path/to/prefixname --mafplot-sample
- QQ图
java -jar kggseq.jar --vcf-file path/to/file --out path/to/prefixname --qqplot --skat-gene [or] --var-assoc
10. 其他一些实用功能
- 计算LD和基因型相关性（--calc-ld）
java -Xmx15g -jar kggseq.jar --vcf-file path/to/file --ped-file path/to/file --out path/to/prefixname \
--calc-ld --db-filter 1kg201204,dbsnp141,ESP6500AA,ESP6500EA \
--allele-freq 0.05,0.95 --regions-in chr4:21212-233454
- 删除高LD的位点（--ld-prune X）
java -Xmx15g -jar kggseq.jar --vcf-file path/to/file \
--ped-file path/to/file --out path/to/prefixname \
--ld-prune 0.9 --filter-sample-maf-le 0.05 --o-svcf
