本文以白细胞介素6为例,介绍基因工程重组质粒构建的一般步骤。
1.准备
本文使用到的两个软件为Vector-NTI-Advance和snapgene:
Vector-NTI-Advance可在http://en.freedownloadmanager.org/Windows-PC/Vector-NTI-Advance.html下载安装;snapgene在 https://www.snapgene.com/ 下载安装免费试用版本。
2.相关DNA或RNA的寻找
在https://www.ncbi.nlm.nih.gov/中可以找到相关DNA或RNA
本文所使用的是白细胞介素6(IL-6)对应mRNA:Human interleukin 6 mRNA, complete cds Accession: M54894.1 GI: 186351
网址为https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/M54894.1
使用Vector-NTI-Advance打开后如图
3.结构基因的确定
点击左侧栏中的feature map,然后点击CDS文件夹,可以发现,其51-689bp区间为其结构基因,故截取该段基因作为目的基因,接下来即将该段目的基因转移到载体上
(CDS是Coding sequence的缩写,是编码蛋白产物的序列,是结构基因组学术语)
鼠标框选区段即为目的基因区段
4.选择质粒
质粒可在snapgene的官网序列库中找到,本文选取pET-30b(+)作为载体
下载后为dna格式
用snapgene打开后可以看到如图结构
5.酶切位点的选择
从图谱中选择多克隆位点区域MCS,点击,并转到序列页面
同时新建DNA序列,将上文提到的目的基因的序列粘贴进去,用于后续的酶切位点分析
1.打开SnapGene,点击New DNA File,弹出以下窗口:
need-to-insert-img
在Create the following sequence窗口下输入DNA序列,并对该文件命名,点击OK。或是 点击Import from Genebank,输入NCBI中某序列的access number,点击OK。
2.此时弹出如下窗口:
need-to-insert-img
3.对该序列进行注释:点击Features→Add Feature,对该序列进行命名注释。
△创建质粒图谱文件方法相同。
酶切位点分析
双酶切连接的酶需要满足以下要求:
1.酶切位点需要存在于MCS中,但同时不能存在于目的基因序列中。
2.两个酶切位点之间至少要有几个碱基间隔,不能紧邻或重叠。
3.最好选择成熟的内切酶。
按照以上原则,筛选酶切位点
本文筛选了BamHI和HindⅢ两个具有相同buffer的酶切位点
6.设计引物
1)PCR引物绘制:打开上文建立好的目的基因文件,在目的基因两侧截取15-30bp序列,点击Primers→Add primers,选择top strand或bottom strand。起始端选择top,终止端选择bottom。
选择的酶切位点为上文中根据质粒筛选的酶切位点
末端引物类似,但要除去终止子
7.扩增
设计好引物后,按CTRL+D或在工具栏中使用PCR进行扩增。进入如图页面:
通过shift键选择两个引物,点击右下角PCR按钮,得到扩增序列。
8.重组质粒构建
点击Actions→Insert Fragment,用键盘Shift键点选上文提到的两个酶切位点,点击Insert,在source of fragment处选择插入的目的片段来源。
将扩增后的目的基因文件拖动到插入框中,在右边栏中选择酶切位点,点击右下角得到重组质粒。
snapgene的部分操作可以参考
http://www.sci666.net/59928.html