这篇文章于2023年7月发表于Cancer Cell（IF=50.3，Clearance of senescent macrophages ameliorates tumorigenesis in KRAS-driven lung cancer），是一篇用特殊工具小鼠探讨衰老对肿瘤微环境组分细胞（主要是巨噬细胞和内皮细胞）以及肿瘤进展的影响，相关探究思路和发现比较新颖有趣，感兴趣的同学可以参考一下。
研究意义：细胞衰老是以细胞周期停滞并伴随基因表达改变，但细胞活性和代谢正常为特征的过程，与癌症和衰老有关。以P16INK4A为代表的细胞周期蛋白依赖激酶抑制蛋白表达上调、溶酶体扩张（β半乳糖苷酶活性增加）和衰老相关分泌物（SASP，包括促炎因子、生长因子和胞外组织重构物质等）的分泌上调是其主要分子特征。最初认为细胞衰老能抑制肿瘤细胞增殖所以具有抗肿瘤作用，但越来越多的研究表明，细胞衰老可以通过SASP介导的细胞间相互作用促进机体衰老及癌症等疾病进展。P16INK4A作为一个被广泛认可的衰老标志物，在衰老和多种癌症进展过程表达增加，而敲除该基因能缓解衰老并抑制肿瘤进展，但P16INK4A对肿瘤微环境（TME）的作用及其具体调控机制未知，且领域缺乏一个比较特异的转基因工具小鼠以在体内水平对其进行功能验证。因此，构建理想的靶向P16INK4A的小鼠，并使用该小鼠揭示细胞衰老对TME的影响及其机制，对肿瘤发病机制解析、新靶点的发现以及肿瘤的临床治疗具有重要意义。
研究策略： 这篇文章以“细胞衰老对肿瘤微环境的影响”为主要探究内容，构建了可以标记以及靶向去除衰老细胞的转基因工具小鼠。利用该小鼠，作者实现了对衰老细胞的体内追踪和操纵，同时结合可标记癌细胞的转基因小鼠，找到了TME中与衰老相关的细胞群体，并利用单细胞和免疫荧光等技术对其进行了鉴定。最后，再在病人样本中进行验证，增强故事的临床意义。
研究方法：
1、Generation of the p16-FDR mouse model
作者首先构建了p16-FDR转基因小鼠模型，在小鼠p16基因3’端插入Flippase重组酶（FLPo）-白喉毒素受体-mCherry融合蛋白编码基因（图1A，FLPo FLPo可以介导FRT序列间的基因重组，从而激活或抑制基因表达；白喉毒素受体可与白喉毒素结合诱导细胞凋亡；mCherry可以表达红色荧光蛋白）。对该质粒系统进行检测的结果显示，衰老p16FDR/+细胞表达mCherry荧光，且mCherry阳性细胞增殖减慢，p16FDR/+和mCherry表达增加（图1B-C）。RNA-seq结果表明，mCherry阳性细胞衰老相关基因表达增加，而增殖相关基因表达减少（图1D）。进一步对插入的FLPo和白喉毒素受体进行检测，向p16FDR/+细胞导入frt-STOP-frt-GFP报告质粒可使GFP表达，而p16+/+细胞没有GFP表达，而且用白喉毒素处理p16FDR/+细胞后细胞大量减少（图1E-F）。此外， p16FDR/+和p16+/+小鼠在生理和肺癌条件下的存活和肿瘤进展没有显著差异（见原文）。年轻和老年小鼠mCherry检测结果显示，老年小鼠多个组织器官表达mCherry。因此，p16FDR/+小鼠适用于p16与癌症及衰老相关性研究。
2、p16INK4a-Expressing cells with senescent features aremostly present in the lung TME
以非小细胞肺癌为模型，以p16FDR/+小鼠为工具，作者探究了p16对肺癌进展的影响。这里作者使用KrasG12D/+；p16FDR/+；Rosa26loxP-STOP-loxP-YFP/+三杂合小鼠（KY-FDR）进行探究（外源导入表达Cre酶的病毒可诱导KRAS-G12D和YFP表达，从而构建癌症模型同时使用YFP对肿瘤细胞进行追踪）。用过表达Cre的腺病毒感染小鼠诱导KRAS-G12D和YFP表达后第8周，KY-FDR小鼠开始表达mCherry，且大部分mCherry阳性细胞表达p16和p21，但不表达Ki67和pRb等增殖标志物，表明细胞处于非增殖/衰老状态（图2A-B）。在感染Cre腺病毒第2周，mCherry与YFP存在明显共定位，表达p16和p21，增殖标志物表达较少。但在感染后第8周，mCherry和YFP共定位显著减少，mCherry阳性细胞表达p16和p21，但不表达增殖标志物（图2C）。用RNA-seq对KY-FDR小鼠来源的三群细胞进行测序和分析（mCherry阳性细胞、YFP阳性细胞以及mCherry和YFP双阴细胞）：mCherry阳性细胞的细胞周期抑制蛋白、SASP以及溶酶体相关基因表达增加，促细胞周期进展基因表达减少，而YFP单阳细胞则相反，双阴细胞则主要富集了免疫细胞相关基因（图2D-G）。因此，非小细胞肺癌TME存在很多p16阳性的衰老非肿瘤细胞。
3、Macrophages and endothelial cells are the predominant senescent cell types found in KRAS-driven tumor-bearing lungs
接下来，作者用探究了mCherry和YFP阳性细胞的类型。YFP阳性肿瘤细胞表达上皮细胞特征性基因，不表达间质细胞和淋巴细胞特异性基因，而双阴细胞则表达淋巴、内皮和间质细胞特异性基因，mCherry阳性细胞表达单核/巨噬等髓系细胞以及内皮细胞特异性基因（图3A）。免疫荧光结果显示，mCherry与巨噬细胞和内皮细胞有明显共定位，且mCherry阳性巨噬细胞大多为M2型巨噬细胞（图3B-C）。所以，TME中的衰老细胞主要是巨噬细胞和内皮细胞。对衰老巨噬细胞的动态改变进行检测发现，mCherry阳性细胞在腺病毒诱导肿瘤后第2、8和16周明显增加，表达mCherry的巨噬细胞比例在诱导后第2周和第8周显著增加（第2周到第16周逐渐减少）（图3D-E）。最后，作者比较了正常年轻和年老p16FDR/+小鼠mCherry阳性细胞及巨噬细胞改变。结果显示，年老小鼠mCherry阳性细胞比例、巨噬细胞比例以及mCherry阳性巨噬细胞数目均显著高于年轻小鼠，这与肿瘤衰老巨噬细胞增加的现象一致（图3D-E）。因此，衰老和患肺癌小鼠的肺部组织表达p16的巨噬细胞增加。
4、Tumor- and age-associated p16INK4a-expressing macrophages in the lung share a unique senescence signature
作者用单细胞测序对TME的衰老细胞进行进一步鉴定（图4A）。大部分mCherry阳性的细胞属于间质/肺泡巨噬以及毛细血管/血管内皮细胞（图4B）。mCherry阳性的间质巨噬细胞和毛细血管内皮细胞其衰老相关基因表达更显著（图4C-F）。通过分析，作者找到了衰老巨噬细胞特异的表面标志物以及和其SASP表型相关的因子。验证结果表明，IL10和CCL2能够显著促进肿瘤细胞增殖，但没有在衰老内皮细胞找到可调控肿瘤细胞生长的相关因子（图4G-H）。对年老p16FDR/+小鼠肺部细胞进行单细胞测序和分析发现，年老p16FDR/+小鼠mCherry阳性细胞分群与肿瘤类似，且肿瘤间质巨噬细胞特征性的SASP相关因子和表面标志物年老小鼠也有表达（图4I-J）。因此，非小细胞肺癌TME的衰老细胞主要是巨噬细胞和内皮细胞，且衰老巨噬细胞的SASP表型相关分子和表面特异性标志物在肿瘤和年老小鼠肺部组织具有保守性。
5、Pharmacogenetic ablation of mCherry (p16INK4A)-expressing cells or senolytic treatment ameliorates lung tumor burden
这部分衰老细胞在肿瘤进展过程发挥什么功能呢？于是作者用白喉毒素DT以及靶向衰老细胞并导致其凋亡的ABT-737（Senolytics）处理肿瘤小鼠，DT或ABT-737处理使衰老巨噬显著减少（图5A）。更重要的是，DT/ABT737处理使小鼠肺部肿瘤细胞显著减少（图5B-C）。用KrasFSFG12V/+小鼠构建的肺癌模型检测结果显示，ABT-737处理显著抑制肿瘤生长并延长小鼠存活（图5D-E）。因此，靶向去除TME的衰老细胞抑制肿瘤生长并促进小鼠存活。
6、Removal of CSFR1-expressing macrophages with senescent features decreases lung tumor burden & Senescent cell ablation in the TME promotes immunoregulation and reduces tumor vasculature
作者用CSFR1抗体靶向去除巨噬细胞。结果显示，CSFR抗体处理有效去除巨噬细胞并抑制肿瘤细胞生长，但对内皮细胞没有显著影响（图6A-C）。那么衰老巨噬细胞是如何影响TME的呢？文献报道指出，去除肺部驻留巨噬细胞可降低TME中的调节性T细胞（Tregs），增加CD8+T细胞，从而抑制非小细胞肺癌。事实上，DT和ABT-737处理小鼠后，肿瘤组织的Tregs和内皮细胞均减少，而CD4+和CD8+T细胞增加（图6D）。此外，用CSFR处理小鼠后，TME的CD8+T细胞显著增加（图6E）。因此，去除衰老细胞（主要是衰老的巨噬细胞）通过改变TME的T细胞亚群种类并抑制肿瘤血管生成延缓肿瘤进展。
7、Human pre-cancerous lung lesions contain a cell population of macrophages exhibiting senescence features
最后，作者用人非小细胞肺癌组织对小鼠体内结果进行验证（AAH、AIS和ADC分别代表该肺癌的早、中、晚期）。结果显示，p16和p21在早期AAH和中期AIS表达最高，而Ki67早、中期表达低，但在晚期ADC中表达高（图7A）。AAH和AIS的巨噬细胞表达大量的p16和p21，但ADC的巨噬细胞表达低水平的p16和p21（图7B）。此外，AAH和AIS衰老巨噬细胞表达衰老巨噬细胞特异性标志物（CD163和FOLR2），但ADC的巨噬细胞不表达该标志物（图7C-D）。因此，人非小细胞肺癌的早中期阶段与TME的衰老巨噬细胞有关。
Take-home message：
这个故事诠释了好的实验工具和实验动物对课题的作用，虽然没有特别深入的分子机制探索，但是作者利用p16-FDR转基因小鼠这一可追踪靶细胞并可随时对目的细胞进行操作的强力工具，实现了对衰老细胞的追踪、分离、分选和分析以及去除，极大方便了实验操作且增强了实验结果的可信性。因此，除了“肿瘤微环境衰老巨噬细胞促进肿瘤进展，是重要的治疗靶点”这一发现外，该动物模型也是本文的一大亮点。所以，平台/资源对课题进展以及文章的发表，大多数时候还是挺有用的。例如这个故事，工具小鼠的使用决定了其最后文章的档次不会太低。此外，这篇文章也能给我们提供一些其它研究方向，例如，为什么肿瘤细胞微环境里的巨噬细胞会衰老，是谁分泌的什么因子介导了这种促衰老作用，为什么这种因子只特异性促进巨噬细胞和内皮细胞衰老？好的故事应该是在关上一扇门时，为我们打开更多的门，而非形成封闭的闭环，suffocate the followers。
