本文发表在nature cell biology，https:/ / doi.org/10.1038/ s41556-019-0299-0，喜欢的老师可以下载阅读。
代谢重编程在肿瘤特别是恶性肿瘤中非常常见，作者发现了这个HISLA可以起到增强乳腺癌细胞的有氧糖酵解和抗凋亡能力，从机制上讲，HISLA可以阻断PHD2与HIF1α的相互作用，从而抑制HIF1α的羟基化和降解。反过来，糖酵解肿瘤细胞释放的乳酸上调巨噬细胞中的HISLA，构成TAMS和肿瘤细胞之间的前馈环路。阻断EV传播的HISLA可抑制体内乳腺癌的糖酵解和化疗耐药。在临床样本中，TAM中HISLA的表达与糖酵解、化疗反应差和乳腺癌患者的生存期缩短有关。（文章还是从基础研究下手，结合临床发现有临床意义，高分必备套路啊）别废话，上图。
敲黑板了，话说糖代谢有哪些途径？我能记得的只有有氧氧化、无氧糖酵解、磷酸戊糖途径，还有别的吗？多了去了，有氧糖酵解了解一下Warburg效应，有氧状态下，肿瘤细胞对糖摄取很活跃，但是利用率低下，通过糖酵解形成乳酸。本文讲了TAM和乳腺癌有氧糖酵解的关系，那么作者上来就直接做表型，发现TAM可促进乳腺癌细胞的有氧糖酵解，抑制细胞凋亡。这里的TAM作者用了CD68标记，别动，这不是M2型巨噬细胞的表面标记物吗？那么研究糖酵解是不是应该了解糖酵解途径相关的蛋白，看看变化情况，这里作者研究了葡萄糖转运蛋白3(GLUT3)和葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)，以及己糖激酶2(HK2)。这个糖酵解是无氧状态发生的，肿瘤因其生长活跃 ，中心部位多数为缺氧区域，所以，通过免疫组化发现在中心区域的肿瘤边缘糖酵解活跃，而且TAM丰富，且TAM与糖酵解定量分析呈正相关。
然后作者又去Oncomine挖数据了，发现CD68+TAM浸润与GLUT3、GLUT1和LDHA(乳酸脱氢酶)表达的相关性，与作者上实验发现结果一致。作者发现在那些新辅助化疗的患者中，与低GLUT3水平和TAM浸润的肿瘤组织相比，高GLUT3水平和TAMS浸润的肿瘤组织中的癌细胞凋亡明显减少。这里出现了两个问题，一个是TAM与糖酵解，一个是TAM与肿瘤凋亡。下面就是愉快的验证环节。作者从人乳腺癌组织中提出CD68+TAM或者用乳腺癌条件培养基培养人血的巨噬细胞促进形成CD68+TAM,然后作者用Transwell实验培养了提取的TAM和人乳腺癌细胞系，发现培养后乳腺癌细胞外酸化率升高，乳酸生成，葡萄糖消耗（这里与未共同培养以及和人巨噬细胞MDMs培养做的对比）。此外，与TAM共培养的肿瘤细胞有较高的糖酵解酶表达，包括GLUT3、HK2、PKM2(丙酮酸激酶同工酶M2)和LDHA。
然后作者又来验证乳腺癌细胞系凋亡是否改变的了，这里做的是FACS（做凋亡、细胞周期好像用这个已经是常规了吧），作者又作了 anoikis assays（也是一种凋亡实验）（作者这是说明了什么呢？肿瘤在TAM存在的情况下即使是脱离了周围的基质也能存活下来，这种凋亡与BCL-2有关，作者不验证一下吗）。
下面继续说糖酵解，无氧状态下糖的利用需要一种重要的蛋白HIF-1α（没错，就是去年刚得诺贝尔的那个研究，我感觉作者有蹭热点的嫌疑），在有氧的状态下它就被降解掉了。看看和TAM培养的肿瘤内部HIF-1α表达情况如何，果然很多，但是，mRNA的水平并没有很多变化，说明了什么肯定有什么玩意儿促进了蛋白的稳定。敲减了HIF-1α后，ECAR、糖消耗、乳酸生成也相应变化了。与糖酵解相关的蛋白也发生了变化.
然后哦，作者又作了凋亡，敲减HIF-1α后凋亡也增多了，说明了HIF-1α在糖酵解和凋亡中起到关键作用了。
介绍了这么多，那么TAM靠的什么本事让肿瘤细胞度过重重困难活下来的呢？通过transwell实验知道肯定不是细胞直接接触，这里又要说外泌体了（如何排除一些分泌蛋白、脂质对肿瘤的作用呢？目前还是个难题，这种情况只能是外泌体和去外泌体上清分别培养看看情况）。作者居然还用了标记观察肿瘤摄取外泌体的过程。然后分别用外泌体、上清、上清+外泌体抗体CD81处理肿瘤，对代谢相关的ECAR、糖消耗、乳酸形成又验证了一波。结果你懂的。刚才不是说凋亡来着吗？作者也作了，只是在补充图里了，其实结果是一致的，就不给上图了。
知道外泌体作用了后，下一步直接找外泌体成分。TAM与MDM外泌体对比找差异来一波。这里用到芯片技术，与未经治疗的MDM相比，pol-TAMs的EVS中88个lncRNAs的表达上调了5倍以上。在这88个lncRNA中，pol-TAMs组有10个比MDM组上调3倍以上，而与pol-TAMs共培养的MDA-MB-231细胞中有7个与未共培养组相比上调2倍以上。此外，定量PCR结合逆转录(qRT-PCR)证实，在pol-TAMs诱导的EVS中，7个LncRNAs中有5个增加了5倍以上，在与pol-TAMs共同培养的MDA-MB-231细胞中，有5个增加了3倍以上，抑制TAM外泌体分泌发现肿瘤中升高的Lnc也相应下降了。说明了肿瘤里Lnc升高时TAM外泌体引起的。
作者在补充实验里在TAM中沉默了上述5个lnc，发现了对肿瘤糖酵解相关的lnc-HISLA，只有沉默了HISLA，才会导致肿瘤糖利用障碍。可以达到与抑制外泌体分泌相同的效果。还记得前两天分享的文章中说的方法吗，直接在靶细胞中沉默它，观察效果，显然，结果与预期一致。
下面该说这个HISLA了，这个对照怎么找，一般非编码lnc的对照就是它的反义链（也就时编码lnc对应的那条DNA单链），剩下的就是做HISLA功能试验了（靶点，gain and loss of function等）。在肿瘤细胞中的异位表达HISLA显著促进了有氧糖酵解，用α-Amanitin(RNA聚合酶II和III的特异性抑制剂)处理MDA-MB-231细胞以抑制内源性RNA转录，并不影响在TAM外泌体处理下HISLA的升高。说明两个问题：1.这个HISLA是外来的 2.这个HISLA不能自己合成（这个好像说的是一个意思啊）。而且在TAM中沉默了HISLA增加肿瘤细胞的凋亡，同时也抑制了迁移和侵袭。然后作者又验证了一波这个HISLA+外泌体进入肿瘤细胞的过程（这不是画蛇添足了吗，上面都验证过了，你也换着图看看，比如外泌体和HISLA共位啥的）
对了，做LncRNA还要做明确几个问题：1.这个LncRNA在是存在的 2.长度要大于200nt，但是也别太长，超过3000nt都不好构建， 3.这个玩意儿不能编码蛋白质 4.这个lncRNA它是有意义的，如果不能互补结合或者与蛋白结合,它存在是没有意义的。作者发现HISLA在TAM外泌体中比MDM的多，而且TAM外泌体处理后的肿瘤比未处理的要多。
作者下一步又为了严谨期间验证了肿瘤微环境TME中各种细胞HISLA的表达情况，发现了我们发现HISLA的表达选择性地表达在巨噬细胞和B淋巴细胞中（作者补充材料里，我这里不加了，不影响阅读）。这表明它的转录是由谱系特异的因子负责的。为此，JASPAR的序列分析揭示了HISLA启动子上转录因子PU.1的典型结合motif(这个motif是什么大家可以去看看一篇网友的文章)，PU.1是髓系和B淋巴细胞发育的关键调节因子。在CHIP试验中发现PU.1与HILSLA启动子区域结合，作者进一步为了验证这个转录因子与HISLA的关系，当然还是构建荧光素酶报告基因，用了一个内源性表达PU.1的THP-1细胞，把HISLA5’端序列插入到荧光素酶基因前方，发现荧光素酶表达增多（与motif突变序列相比），在TAM细胞水平沉默了PU.1后发现HISLA表达也降低。至此，说明了PU.1与HISLA的关系。
从前面的测序结果知道TAM比MDM HISLA的表达要多，说明TAM表型变化促进了HISLA的表达，那结合以往的经验，说明TAM表型改变相关的物质包括GM-CSF和乳酸，验证后表明是乳酸刺激了HISLA的表达。作者又在附加资料中验证了多少浓度的乳酸可以诱导TAM表达HISLA增加（5mM）。
更奇怪的是，高表达HISLA的TAM，HIF-1a也高表达，也进行着糖酵解。抑制肿瘤乳酸释放也减轻了TAM的糖酵解过程。
这个乳酸提高了HISLA的表达，和PU.1什么关系，然而作者附加实验验证了，并没有，但是结合HISLA升高的事实，那么找到这个C是什么，再次看看HISLA的motif结合因子，发现了ERK下游的ELK1，既往也报道过乳酸刺激ERK信号通路的研究，TAM中ERK高表达，沉默ELK1或者加入ERK抑制剂果然减少了HISLA的表达，说明了HISLA的表达是通过不同的途径进行的，作者得出结论：髓系特异性PU1介导HISLA的基础表达，而乳酸通过ERK-ELK1信号进一步上调HISLA。（掌声在哪里？？）
说了这么多，HISLA是怎么和HIF-1a起作用的呢（无非就是促进MRNA表达，稳定mRAN或者抑制HIF-1a降解，说着简单，其实很复杂，要验证很多东西的）？前面说了肿瘤内HIF-1a的蛋白和mRNA无相关性，说明蛋白半衰期延长，通过免疫共沉淀和免疫印迹结果显示TAM 外泌体处理或与TAM共培养的MDA-MB-231细胞中，缺氧诱导因子-1α的羟基化和降解明显减少。表明这些细胞中的PHD2和VHL的功能受到抑制。然而，PHD2和VHL的表达在用或不用TAM 外泌体处理的MDA-MB-231细胞中是相似的。重要的是，减少外泌体或者肿瘤细胞的HISLA均增强了HIF-1α的羟基化和降解，过表达结果正相反。
是不是需要做一下RIP拉一下看看结果了。然后在共位一下看看啊！！安排。
利用体外系统和重组蛋白，将HISLA加入而不是HISLA-AS发现HIF-1a与PHD2的结合减少，作者在体外把标记的HISLA与PHD2或HIF-1a进行孵育，作了RIP，发现拉下了PHD2。以上验证了HISLA的作用靶点，Lnc的核苷酸链很长，究竟是哪一段参与到结合作用中去呢，这就需要分段构建后再进行RIP（这工作量，沃特福WTF）,发现HISLA(HISLA190-248)的190-248核苷酸形成茎环结构是唯一与PHD2相互作用的基序此外，破坏HISLA190-248茎环结构的核苷酸突变取消了HISLA和PHD2之间的相互作用。将HISLA190-248加入到体外系统也抑制了HIF-1a与PHD2的结合，异位过表达HISLA190-248也显著抑制了HIF-1a的羟基化降解
机制部分说到这个是不是已经很明了了，下面总结一小下：肿瘤相关的TAM选择性聚集在肿瘤中心边缘缺氧区域，TAM自身表达HISLA通过外泌体释放被肿瘤摄取，肿瘤利用HISLA抑制了PHD2的功能，促进了HIF-1a的集聚，使肿瘤可以在缺氧环境下继续利用葡萄糖代谢产生能量，同时副产物乳酸又能够协同刺激TAM，通过ERK-ELF1轴刺激HISLA的转录，增强了TAM 外泌体对肿瘤代谢物重编程的过程。体外和机制讲完了，是不是还缺了体内和临床。来来来，继续整起。作者也是联合肿瘤和TAM或TAM的外泌体注射到裸鼠乳脂垫中进行成瘤分析。发现联合TAM或者TAM外泌体的那批裸鼠肿瘤更大，对化疗耐药。
他们还给裸鼠作了PET-CT，有钱，有钱，WTF。让我已瞎的眼又瞎了一遍。
他们还发现HISLA及TAM外泌体在肺转移中还有作用。我的眼。你能信，不加TAM中立都不转移，加了就转移。
体内结束了，该临床了，无非就是检测血中HISLA与临床相关性的问题。首先HISLA与CD68+TAM增多相关，而且文章开始说的那些蛋白相关，其次，肿瘤HIF-1a与HISLA相关 ，最后，血中的HISLA与对应肿瘤中分离的TAM中的HISLA相关。在组织病理水平，HISLA高表达与组织学分级、分期、淋巴结转移及HER2亚型有关。此外，高水平的HISLA表达和GLUT3表达与患者较差的无病生存率相关，进展期或稳定期乳腺癌患者在新辅助化疗前获得的肿瘤活检组织中HISLA的表达比部分或完全缓解者高得多。我就不解释了，直接上图吧，临床相关这部分都是文章最简单的地方了。
至此，本文结束了，这篇文章以前读过，但是，那时刚接触科研，对其中一些道理也不是很清楚，只是知道个框架，现在回头看看，还是有很多收获，文章结构严谨，基本上还是围绕了HISLA进行展开，结合细胞、组织、体内、体外、临床进行相关分析研究，并没有局限在由A到B的论证途径，发现了一些潜在的C，也说明了生物体调控是复杂的，并不是单一的，每一个生物过程都应该是多系统、多基因参与的，这样才能达到调控的精准，同时文章的临床应用价值我自认为还是比较大的，肿瘤生长需要血管，需要一个适宜的微环境，当环境改变的时候可以让肿瘤代谢重编程，这在所有实体肿瘤中几乎是普遍存在的现象，如果能够在这个过程中找到相应治疗的靶点，将会对肿瘤治疗产生翻天覆地的变化。文章应用了包括芯片技术、RIP、CHIP、pull-down、FACS等高大上的技术加持，上分还是很容易的，可能作者也蹭了当下的热点：外泌体，非编码RNA、HIF-1a（诺奖），如果入门非编码领域研究的话算得上是一篇非常不错的范文。谢谢大家！如有错误，望批评、指正。
