一、背景

大肠杆菌是人类和大多数动物肠道的正常居民，一些大肠杆菌菌株可引起多种肠道和肠外疾病，例如腹泻，此外，大肠杆菌是导致食物中毒的主要常见病原体之一。人们付出了巨大的努力来生产新的抗菌药物来控制细菌感染，由于细菌之间的抗生素耐药性增加，抗生素治疗在大多数细菌感染中失效。抗生素耐药性发生率的增加会给此类疾病的治疗带来额外的问题，因此寻找预防此类疾病的新疗法就尤为重要。

二、目标

最近，科学家们专注于并有意使用来自鸡卵的IgY抗体进行免疫治疗和诊断，因为它具有独特的生物活性。为了预防细菌感染，使用IgY有几个优点，例如它可以很容易地通过水稀释方法从蛋黄中大规模分离，而无需使用任何化学品或有机溶剂。此外，产蛋母鸡的抗体产量高于其他母鸡，更重要的是，来自哺乳动物血液的IgY既耗时又昂贵。基于上述报告，本研究的指定目标如下：

1. 生产针对大肠杆菌的蛋黄免疫球蛋白（IgY）。

2. 通过ELISA法鉴定血清中抗大肠杆菌蛋黄免疫球蛋白（IgY）。

三、材料和方法

1. 实验动物

四只50周龄的通过鸟类饲养的白色高线鸡，并饲养在卡拉季奥尔伯兹医科大学医学院的动物屋中。它们被用于生产抗大肠杆菌抗体（IgY）的研究。

2. 大肠杆菌的鉴定

大肠杆菌获自卡拉季阿尔伯茨医科大学医学院微生物学系，是从患有急性腹泻的儿童中分离出来的。

3. 抗原的制备

大肠杆菌在脑心浸液肉汤中于37˚C培养过夜。通过离心（15分钟，3000rpm）收获细菌，用PBS（pH 7.2）洗涤3次，然后通过比较0.5 McFarland以108个细胞/mL的密度重新悬浮在PBS中，并记录600 nm处的细胞OD。为了杀死大肠杆菌，使用浓度为10%（vol/vol）的甲醛，并将悬浮液在 4 ˚C下保持16小时。为了去除甲醛，将大肠杆菌用PBS洗涤两次并重新悬浮在无PBS中。通过将大肠杆菌在MHA上在 37˚C下培养24小时，确认完全杀死并将悬浮液储存在20˚C。

4. 鸡抗大肠杆菌抗体的研制

鸡接受四次注射，一次初级注射和三次加强注射。对于主要注射，使用Herbert等人的程序，用等体积的弗氏完全佐剂（FCA）乳化500μL抗原。然后在鸡胸肌的一处肌肉注射溶液。通过相同的给药途径以14天的间隔给予3次含有弗氏不完全佐剂（FIA）的抗原加强注射。在免疫前从鸡中收集两毫升血样作为免疫前血清。

5. 血清分离

通过以3000 rpm离心10分钟来分离血清，并在20˚C下储存直至使用。

6. 通过间接ELISA测定血清的抗体效价

抗体效价通过如Sunwoo等人所述的酶联免疫吸附测定（ELISA）程序确定。

四、结果

通过ELISA检测蛋鸡血清中抗大肠杆菌抗体的活性，如图1、2和3所示。

免疫母鸡产生的特异性抗体滴度从第一次注射开始迅速增加，并在第四周第二次加强注射后达到高峰，并保持稳定两周。然而，该受试者显示的最后一次加强注射后其下降，以实现抗体效价的稳定性，需要重复加强注射（图1）。此外，将血清稀释度与对照组（免疫前血清）进行比较表明，血清中存在高达1.10000稀释度抗体，这表明免疫鸡产生了大量抗体（图2和3）。

五、讨论

将IgY施用于宿主病原体是建立保护性免疫的一种有吸引力的方法，特别是针对人类胃肠道病原体；此外，科学家报告说，IgY已被用于抑制食源性病原体的生长。此外，禽类抗体的特异性通常与可比较的哺乳动物抗体的特异性显着不同。这样做的一个重要后果是类风湿因子（RF）不能与IgY结合。RF是许多免疫测定中的主要干扰源，是一种与哺乳动物IgG的Fc部分反应的自身抗体。通常与RF相关的疾病是类风湿性关节炎，但RF也存在于患有许多其他疾病的患者的血清中。大多数免疫测定使用哺乳动物多克隆或单克隆抗体，它们容易与RF结合，从而产生假阳性结果。然而，RF不能与IgY分子结合；因此，鸡抗体可用于检测（例如比浊法、乳胶聚集或ELISA），但RF可能会干扰。除了生物学差异（RF识别）外，分子结构的差异会导致各种物理化学差异（溶解度、吸附亲和力、等电点等）。IgY的重链（H）大于哺乳动物IgG的重链（H），并且在抗原性上不同于哺乳动物IgG。

在本研究中，通过ELISA测定的血清中特异性免疫球蛋白Y的活性和滴度表明存在针对特定病原菌的抗原特异性抗体。正如其他人报道的那样，ELISA是一种灵敏的技术，可以在不同的纯化过程中找出抗体滴度。必须进行进一步的研究以评估这些抗体在治疗各种疾病中的效力。这项研究工作的结果将成为当前抗生素治疗的替代方案。如前所述，这些IgY治疗具有多种重要意义，例如与用于控制大肠杆菌等病原菌的常规哺乳动物抗生素相比，它更安全、更有效且更便宜。最近，日本在IgY的产业化方面取得了成功，将IgY作为生物活性成分应用于食品、保健品、化妆品等领域。必须进行进一步的研究以评估这些抗体在治疗各种疾病中的效力。这项研究工作的结果将成为当前抗生素治疗的替代方案。

文献来源：Enayatollah Kalantar, Mohammad Mehdi Soltan Dallal, et al. Detectionof Egg Yolk Immunoglobulin Y: a Potential Source of Anti-Escherichia coli