Nature | 神经胶质瘤可重塑功能性神经回路并影响患者生存

原创 Carlos 图灵基因 2023-05-11 10:12 发表于江苏

撰文：Carlos

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亮点:

1、作者证明了神经胶质瘤会重塑功能性神经回路；

2、作者阐述了神经胶质瘤对神经回路的重塑会对患者的生存和语言任务的表现产生影响。

美国加州大学旧金山分校的Shawn L. Hervey-Jumper教授课题组在国际知名期刊Nature在线发表了题为“Glioblastoma remodelling of human neural circuits decreases survival”的论文。胶质瘤以突触方式整合到神经回路中。先前的研究表明，神经元和神经胶质瘤细胞之间存在双向相互作用。作者利用清醒人类词汇检索语言任务期间的颅内脑记录，以及特定部位的肿瘤组织活检和细胞生物学实验，发现神经胶质瘤重塑了功能性神经回路，使任务相关的神经反应激活了肿瘤浸润的皮层。而作者还发现来自肿瘤和大脑其他部分之间表现出高度功能连接的区域的定点活检富集了胶质母细胞瘤亚群，该亚群表现出不同的促突触和神经营养表型。另外胶质母细胞瘤和正常大脑之间的功能连接程度对患者的生存和语言任务的表现都有负面影响。

这些结果表明，高级别胶质瘤在功能上重塑了人脑中的神经回路，这既促进了肿瘤的进展，又损害了认知。

为了检查胶质母细胞瘤浸润皮层的认知任务特异性神经元活动，作者选择了一组在外侧前额叶皮层（LPFC）有皮质投射肿瘤的成年患者。皮层电图（ECoG）电极放置在肿瘤浸润和正常出现的皮层上。结果高伽马能带范围功率（HGp）与局部神经元群体尖峰密切相关，并因皮层过度兴奋而增加。

作者发现，当患者清醒并说话时，记录单个电极的HGp和组学水平分析。来自对照和非肿瘤条件的HGp数据证明了LPFC内言语运动规划的预期神经时间过程，与先前在非人类灵长类动物和人类中建立的言语启动模型一致。接下来，作者又进行了同样的分析，只关注肿瘤浸润皮层的电极阵列记录。与胶质母细胞瘤-突触整合可能导致生理失调的神经反应的理论相反，在肿瘤浸润皮层的整个区域内发现了与任务相关的神经活动，包括通常与语音产生无关的皮层区域。这一显著发现表明肿瘤诱导的语言回路功能重塑。

同时作者发现，在2-4级胶质瘤亚型中，LPFC内维持了言语启动的任务特异性神经元反应。这些发现表明，受肿瘤影响的皮层内的神经元活动是有生理组织的，包括在通常参与语音产生的区域之外的区域中由语音任务引发的神经活动。鉴于这一发现，作者研究了受肿瘤影响的皮层语言区域的神经反应量是否不同。结果表明胶质母细胞瘤浸润的皮层在语音产生过程中HGp增加，与超兴奋性一致。

作者使用逻辑回归分类器来区分低频和高频单词试验条件，确定了来自正常出现和胶质母细胞瘤浸润皮层的神经元信号的可解码性。在低频和高频单词试验之间，正常出现的皮层产生了高于机会的解码。相反，胶质母细胞瘤浸润的皮层并没有解码单词试验。这些数据进一步表明，胶质母细胞瘤浸润到人类皮层，维持了任务特异性的神经支配反应，包括神经元过度兴奋，但受肿瘤影响的皮层失去了解码复杂单词条件的能力。

在证明了胶质瘤重塑神经回路后，作者接下来检查了特定的分子定义的胶质瘤细胞亚群是否影响肿瘤与神经回路的功能整合。

为了对胶质瘤内的功能连接区域进行采样，作者使用脑磁图(MEG)测量了胶质瘤浸润性脑内神经元的振荡，并在手术切除肿瘤期间采集了具有不同功能连接的原发患者胶质母细胞瘤组织。在磁共振成像(MRI)上，在对比度增强或T2/FLAIR高信号的肿瘤区域内发现了与肿瘤浸润性皮质内神经元活动相关的瘤内功能连接和高功能连接(HFC)体素。

为了研究功能连接、HFC和非功能连接的低功能连接(LFC)肿瘤区域之间的差异，作者进行了批量和单细胞RNA测序分析。批量RNA-seq转录分析显示，在HFC肿瘤区域，与神经回路组装有关的基因上调，包括轴突寻路基因(NTNG1)、突触相关基因和突触生成因子，包括七倍上调的血栓反应蛋白-1(THBS1，编码TSP-1)。

THBS1编码一种已知的由星形细胞在健康大脑中分泌的突触生成因子。为了进一步探究细胞亚群对THBS1表达的影响，作者对HFC和LFC肿瘤区域的活检样本进行了单细胞测序分析。发现2.44%的肿瘤细胞表达THBS1，并且与LFC肿瘤细胞相比，HFC肿瘤细胞表达更高水平的THBS1。在LFC区域样本中，THBS1的表达主要来源于非肿瘤星形胶质细胞群体。这表明，在低连接的肿瘤内区域内，星形胶质细胞主要表达THBS1，而在HFC区域内，除了星形胶质细胞和髓细胞外，高级胶质瘤细胞还表达THBS1，这可能促进观察到的神经回路重塑。

相关结果表明，小胶质细胞表面分子CD36和CD47可作为TSP-1受体发挥作用。TSP-1的髓细胞表达表明，HFC区域肿瘤微环境中多种细胞类型可能有助于突触连接的改变。

通过使用HFC和LFC患者来源的胶质母细胞瘤活检组织的蛋白质水平分析证实了HFC区域内THBS1的表达升高。与转录组学图谱一致，免疫组织化学分析显示HFC组织中TSP-1表达增加。免疫荧光和共聚焦显微镜分析证实，恶性肿瘤细胞在HFC组织中表达TSP-1。

HFC区恶性肿瘤细胞亚群产生TSP-1的事实表明，HFC区肿瘤细胞促进突触发生并进而促进连接的潜能不同，这与细胞亚群在异质癌症系统中发挥不同作用的癌症生物学原理相一致。

作者接下来检查与HFC相关的胶质瘤细胞是否促进结构性突触的形成，类似于正常的星形细胞和某些星形细胞样脑胶质母细胞瘤细胞。

作者首先使用免疫组织化学和共聚焦显微镜分析了原发患者HFC和LFC区域的胶质母细胞瘤活检组织。结果发现与LFC区相比，HFC区突触前神经元点状突触(突触素-1)以及突触后点状密度和神经元簇大小(PSD95+神经丝+)增加，突触蛋白-PSD95点状共存。这些数据表明胶质母细胞瘤高连接区突触稳定性和/或突触形成增加，支持TSP-1在胶质瘤相关神经回路重构中的作用。

随后作者将HFC和LFC肿瘤区域的高级胶质瘤细胞与小鼠海马神经元共同培养，以测试TSP-1高表达和TSP-1低表达的原发性患者衍生的胶质瘤细胞对神经元突触连接的影响。结果表明，与LFC-神经元共培养相比，HFC-神经元共培养的神经胶质瘤和神经元过程中的共定位点数量增加，表明HFC神经胶质瘤细胞在突触发生中的作用。

为了进一步研究从HFC和LFC区域分离的恶性亚群之间的功能差异，作者在神经元器质模型中测试了神经元-胶质瘤的相互作用。

作者将HFC和LFC神经胶质瘤细胞与GFP标记的人脑胶质瘤细胞共培养，后者是从诱导的多能干细胞(IPS)细胞系中获得的，整合了强力霉素可诱导的人Ngn2转基因，以驱动神经元分化。对诱导神经元细胞器中突触后HOMER-1的定量显示，与LFC胶质瘤细胞相比，与HFC胶质瘤细胞共培养时，突触后点状突触密度相对增加。

值得注意的是，在诱导神经元-LFC共培养中外源性给予TSP-1逆转了这一表型，并促进了LFC胶质瘤与神经元器质的牢固整合，进一步暗示TSP-1参与了神经元-胶质瘤的相互作用。

用多电极阵列(MEA)电生理学方法分析TSP-1高表达细胞与神经元共培养的电物理特性。共培养48h后，皮层神经元与TSP-1高表达的HFC细胞共培养的网络爆发总数较单独培养或LFC共培养条件下的皮层神经元增加。结果表明：胶质瘤表现出肿瘤内的异质性，肿瘤细胞亚群承担特殊的角色。

上述结果表明，在脑回路正常的胶质母细胞瘤中，功能整合的局部性异质性，并提示在HFC的肿瘤内区，存在一个具有突触发生特性的肿瘤亚群。

接下来，作者研究了TSP-1高表达的HFC胶质瘤细胞浸润性小鼠脑内的结构突触。结果显示，HFC胶质瘤移植瘤的突触总数显著高于LFC胶质瘤移植瘤，进一步表明从HFC患者肿瘤区域分离的胶质瘤细胞具有更大的突触生成潜力。

作者发现，来自HFC和LFC区域的原发患者活检组织显示HFC区域Ki-67增殖标记染色增加。为了检测HFC细胞对神经因子的反应是否与LFC原代培养的细胞相比有变化，患者来源的HFC细胞和LFC细胞单独培养或与小鼠海马神经元共同培养，用EdU处理过夜。HFC胶质瘤细胞在与神经元一起培养时，增殖能力增加了5倍。相比之下，LFC胶质瘤体外细胞增殖指数与体外培养的海马神经元和不表达EDU的细胞相似。

这些结果表明，HFC细胞的增殖能力取决于神经元分泌因子的存在，在缺乏神经元信号的情况下，它们往往会获得休眠的肿瘤表型。

作者接下来使用球形侵袭试验测试了神经元条件培养液对HFC和LFC胶质瘤细胞侵袭的影响。有无神经元条件培养液对LFC胶质瘤细胞的球体体积无明显影响，但HFC胶质瘤细胞对神经元条件培养液的侵袭面积增加。除了侵袭面积增加外，HFC胶质瘤细胞还延长了代表肿瘤微管的长突起，以回应神经元条件培养液。

在有或无神经元条件培养液的情况下，对TSP-1高表达的HFC和LFC细胞进行扫描电子显微镜(SEM)，显示连接HFC细胞的细胞质延伸。作者还对平均球体体积的变化进行了量化，发现，神经元条件培养液增加了HFC的侵袭力和微管长度，但不增加LFC细胞的长度。

原代患者来源的HFC细胞然后用shRNA对照或针对THBS1的shRNA进行转导，以敲低TSP-1。与对照条件相比，HFC细胞中THBS1的敲除减少了肿瘤微管的数量，这与TSP-1在肿瘤微管形成中的已知作用一致。

作者对患者来源的HFC或LFC胶质瘤细胞进行了原位异种移植的小鼠的存活研究。与LFC肿瘤异种移植小鼠相比，携带HFC肿瘤的小鼠表现出更大的肿瘤负担和更短的生存时间。

综上所述，这些结果表明，对于对神经元信号有不同反应的肿瘤细胞群来说，功能连接的肿瘤内区域得到了丰富，并在神经元微环境中表现出增殖、侵袭和整合的表型，这对临床前模型中的生存产生了负面影响。

作者对新诊断的胶质母细胞瘤患者进行了人类生存分析。在控制了已知的与生存率相关条件后，使用MEG在肿瘤浸润的大脑中测量神经振荡和功能连接。Kaplan–Meier生存分析显示，有功能连接的患者的总生存期为71周，而没有HFC体素的参与者的总生存率为123周，这表明肿瘤的生存期和功能连接之间存在显著的反比关系。

作者接下来使用partDSA算法进行递归分割生存分析。第一个划分是基于已知的风险因素，如年龄和肿瘤切除的程度。在这种分层划分模型中，连通度被确定为第二个最重要的变量，它将风险组2和3划分开来。风险组1（黑人）的预后最差，是72岁以上或任何年龄段肿瘤切除率低于97%的患者的组合（次全切除）。风险组3（灰色）的存活率最高，这些患者年龄小于62岁，肿瘤切除率超过97%，肿瘤缺乏功能连接。中等风险组2（红色）揭示了年龄和氢氟碳化合物之间有趣的相互作用。该组有两个亚群：肿瘤切除率超过97%且年龄小于72岁且具有肿瘤内连接的患者；以及62至72岁之间没有功能整合的患者。这些结果证明了功能连接对生存率的显著预测价值。

作者检测了TSP-1，结果显示患者血清中的循环TSP-1水平与肿瘤内功能连接呈显著的正相关。在优势半球胶质母细胞瘤患者队列中进行了视觉图片和听觉命名测试。肿瘤内HFC体素数量与语言任务表现的线性回归表明，语言认知表现与肿瘤功能连接之间呈反比关系。这些发现表明，胶质母细胞瘤与神经回路的功能整合会对认知和生存产生负面影响。

最后作者靶向TSP-1，阻断血栓反应蛋白受体α2δ-1。在神经元-胶质瘤共培养中，单独的棘波、爆发(棘簇)和同步网络爆发在GBP作用24-48小时后减少。

原代患者来源的HFC细胞用shRNA对照或针对THBS1的shRNA进行转导，或用GBP处理。使用GBP的TSP-1抑制不影响单独培养的HFC细胞的增殖，证实GBP没有肿瘤细胞的内在效应。对携带HFC患者来源的PDX小鼠给予GBP导致携带HFC异种移植的GBP治疗的小鼠的胶质瘤增殖显著低于赋形剂治疗的对照组。

教授介绍

Shawn L. Hervey-Jumper博士是神经肿瘤学会、美国癌症研究协会、北美颅底学会、美国神经外科医生协会（AANS）和神经外科医生大会（CNS）的成员，加州大学旧金山分校神经外科副教授。同时Hervey Jumper是一名神经外科医生，专门治疗脑肿瘤患者，包括低级别和高级别胶质瘤、脑膜瘤、脑转移和神经皮肤综合征。Hervey Jumper的研究探明了脑肿瘤如何侵犯大脑中影响我们移动、说话和思考的重要区域。他还探索了促进大脑恢复和修复的策略。此外，他还研究了在手术过程中绘制人脑地图的方法，目的是将损伤限制在关键功能区域。

参考文献

Krishna S, Choudhury A, Keough MB, et al. Glioblastoma remodelling of human neural circuits decreases survival.Nature.2023;https://doi.org/10.1038/s41586-023-06036-1