前期文章：
- 我们用两篇文章的篇幅大概讲了一遍质粒骨架及其各个要素的介绍：
解剖式学习一个质粒结构--update
质粒系列之什么是质粒 - 再谈了最传统的限制性克隆：
质粒系列之限制性克隆--restriction cloning - 前面还夹杂的讲过一些piggybac、gateway、RMCE的一些内容：
基因编辑如何换药不换汤 -
慢病毒系列也有讲过两篇：
团队作案HEK293，史上最强搬砖细胞
不想再用慢病毒了，我还有什么别的选择吗？piggyBac transposon - 此外我们本还有一个CRISPR screening的专题，只有开头，未得完善：精准大海捞针--5. CRISPR screening专题
- 质粒系列之再谈无缝连接--Gibson assembly
- Golden Gate，质粒改造的王者
在简书上更新学习笔记的初心是希望大家一起讨论学习，集思广益。每个人遇到的问题和解决方法都可能不一样，通过互相分享，达到学习最大化。最近我的简书才开始更新，在这之前已经断更蛮久了，虽然我的简书平台断更很久，但还时常能收到评论或者提问。好多问题都是我未曾考虑过的，因为他们的提问，我多了一个思考的角度，受益颇多。因此还是诚邀大家多多给我提建议，多多的分享经验，在这里先谢过啦！
1. 引子
今天这篇文章是最近一个读者的提问引申开来的，而这个问题其实被问了不止一次。
提问者担心瞬转不能达到基因敲除的效果。如只是回答表面上的问题，可从以下角度思考：
选用的CRISPR-Cas9基因修复的方式：同源重组修复（Homology-directed repair，HDR）还是易出错的非同源末端连接 Non homologous end-joining，NHEJ。这两种修复方式的速率如何？
而这个问题还有一个引申的问题：
假如我认为瞬转效率不高，想要使用稳转的CRISPR-Cas9方式是否会更好？有何潜在的问题？
一直以来我们都知道CRISPR-Cas9的最大的隐患是脱靶效应（off-target effect）。近几年来有研究表明CRISPR-Cas9还有其他的隐患，每次这些相关性文章一发表，CRISPR相关公司的股票都会出现大跌。今天我们先就脱靶效应来聊一聊，并且提出检测方法。
2. HDR还是NHEJ
2.1 CRISPR-Cas9不仅仅是切割，还有修复
从CRISPR-Cas9的名称来看，我们很容易理解这是一个由CRISPR记账小本本转出来的gRNA介导Cas9切割靶基因的故事。需要注意的是，这个切割是一种DNA双链断裂（double-strand break，DSB），因此修复方式一般有HDR、NHEJ以及MMEJ。关于这几种DNA修复方式的不同可以参考我们之的文章，内有详细介绍：CRISPR-Cas9实验 ，顺利的话扎实，不顺利扎心。
三种DSB修复方式对比如下**
（1）MMEJ不能像HDR那样完美的精准修复，但它却比NHEJ更容易预测，DSB两侧的短同源区域（5-25 bp）可以定位到基因编辑的目标DNA序列，即<u>精准度：HDR > MMEJ > NHEJ</u>。
（2）但对于没有良好HDR系统的物种，即使存在修复模板，其修复方式仍然是NHEJ；
（3）HDR的同源性越长，重组效率越高，但同源臂越长，克隆时间就越长。相比之下，MMEJ的短同源序列较易通过PCR扩增得到。<u>效率和简单程度：NHEJ > MMEJ > HDR</u>；
（4）NHEJ虽然效率高，但是易出错；HDR精准度最高但是效率却最低；因此在MMEJ活性允许的情况下，也可以达到敲入、替代或删除核苷酸的效果，但效率低于NHEJ；
（5）NHEJ、MMEJ活跃于整个细胞周期，而HDR则仅在S后期-G2期，这也是NHEJ效率更高的原因之一。
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由此可见，选用NHEJ修复导致移码突变，以达到基因敲除的方法。NHEJ活跃于整个细胞周期，只要细胞被转入gRNA-Cas9质粒，几乎在24小时内可以完成基因编辑。因此从速率上并不需要太担心，反而为提高单克隆筛选效率，应着重提升质粒转染效率。可通过从以下角度调整：
（1）降低细胞接种密度至30-50%。
（2）选用合适的转染试剂，并给足量，如干细胞可选用Lipofectamine Stem。
（3）选用适当的质粒-脂质体复合物溶液，如用OPTI-MEM代替无血清培养基。
（4）将成团细胞单细胞化接种，使用胰酶消化团块细胞至单个，吹打混匀后接种时可加入Rock Inhibitor，可保持细胞接种存活率，同时维持细胞单细胞化。
综上所述，瞬转质粒不存在KO不掉的问题。
3. 瞬转还是稳转
即使瞬转不存在KO效率问题，但瞬转必然会涉及到单细胞克隆的挑选。为避免这一繁杂的步骤，不少人选择使用慢病毒转gRNA-Cas9的方式，通过药筛可以获取稳转细胞株，并最终得到KO细胞株。
首先，严格来说，使用慢病毒获取稳转gRNA-Cas9细胞株也需要挑选单克隆细胞，以备后续实验。
其次，慢病毒转染有多种方式，不同方式有不同的后果：
（1）稳转gRNA-Cas9细胞株会存在不断切割的情况，此时脱靶效应也会累积，对研究产生无法预计的影响。
（2）慢病毒稳转Cas9，必要时加入gRNA瞬转质粒，以控制基因编辑脱靶效应。事实上有文章表明仅仅是Cas9的过表达都会对细胞造成影响，我们将在下一篇推文介绍这篇文章内容。
（3）慢病毒稳转gRNA，必要时加入Cas9瞬转质粒或者蛋白，以达到基因敲除时间点的控制和减少脱靶效应。
还有一种是财大气粗：无论瞬转稳转都不选，直接投放体外制备的gRNA-Cas9蛋白复合物即可。
讲了这一些，似乎本人很不推荐稳转这种方法？其实这依据个人的实验目的选择。那些需要有稳定基因背景的研究来说，最好的选择是快敲不残留的方法（瞬转）。对于追求速度，不拘泥于什么基因敲除效果，尤其是文库筛选（CRISPR-Cas9 library screening），则使用慢病毒的方式是相对适宜的。选用哪种方式，需要多多考量。
4. CRISPR-Cas9脱靶效应
CRISPR/Cas9系统是一种多功能的基因组编辑工具，因为它能够高效地靶向与其gRNA互补的DNA序列。
然而，已有研究表明，RNA引导的Cas9核酸酶能够切割与引导链不匹配的基因组DNA序列。这就造成了脱靶效应。由于脱靶效应的存在，其实大家在拿到成功的基因敲除细胞之后，还需要做脱靶效应预测并使用桑格测序验证。有不少网页工具可以使用，这里以张峰实验室网站上列出的工具为例。
Off-spotter
界面：这个工具相对直观，只需要设定种属、Cas蛋白类别，给定gRNA序列以及限定碱基错配数量即可。而其推测的脱靶结果也十分直观，感兴趣可以自行到官网查询。
Cas-OFFinder
界面：Cas-OFFinder可选择的内容比Off-spotter要多，界面也很直观。但相对Off-Spotter来说，增加了DNA/RNA Bulge的选项。
DNA/RNA bulge：与gRNA匹配时，当DNA序列包含插入(DNA隆起)或缺失(RNA隆起)时，基因组位点可以被CRISPR/Cas9系统切割，用于配对切割的Cas9 nickases也可以容忍其中一条引导链的隆起。该文章发表于2014年的Nucleic Acid Res，标题为CRISPR/Cas9 systems have off-target activity with insertions or deletions between target DNA and guide RNA sequences，直观来看，可如下图：
结果显示：Cas-OFFinder的结果界面更为复杂。目前我会选在排名前10的脱靶位点进行验证。优先选择mismatch最少的target。而后可能考虑DNA/RNA bulge。还是一样的设计PCR引物，将目的位点扩增并送桑格测序。
5. 结语
在理想状态下，我们希望基因编辑后的细胞没有脱靶效应、核型正常。但意外是有发生，建议在拿到单克隆细胞株并通过桑格测序后，尽快进行核型分析。我们的经验表明，即使编辑的基因没有影响基因组稳定性的作用，还是有可能发生核型改变。趁早完成，以放心进行下一步实验。
在这篇文章我们只提到了脱靶效应，实际上由于CRISPR-Cas9造成的缺口是DSB，这必然会引起P53相关的DNA损伤反应，这是CRISPR-Cas9应用的隐患之一；另外，Cas9稳定表达同样会对细胞造成影响，增加CRISPR-Cas9的应用风险。由于篇幅有限，在这边文章我们不再展开，下一次我们会挑经典的文章进行介绍，并解释原因。最后，之前挖的Gateway克隆的坑一定会找时间补上。谢谢大家哦！
