发育轨迹分析是单细胞分析中比较常见的一种分析，旨在预测出细胞类型之间的发育关系，构建细胞的发育轨迹。常见的发育轨迹分析有很多，例如monocle2/3，RNA velocity等。今天小编就来简单介绍一下我们在日常分析中的RNA velocity流程。大家如果想了解RNA velocity的原理，也可以参考一些网上的文章（RNA velocity of single cells文献学习）
话不多说，我们直接进入正题吧~
1. 软件安装
在安装之前需要安装以下依赖包：
conda install numpy scipy cython numba matplotlib scikit-learn h5py click
pip install pysam
安装velocyto
velocyto依赖python3，但是我目前都是python2，所以需要安装python3
conda install -c bioconda velocyto.py` </pre>
conda安装velocyto的命令是怎么找到的，请参考conda安装软件指南，或者参考velocyto官网安装指南
但是在安装的过程中总出现以下的报错信息：随后我又查了一些资料：conda中python环境的配置，发现安装软件的时候可以在命令后添加python=2/3，用这种方式来调用python的版本，随后我也这样尝试了一下，果不其然，这样操作以后就可以正常安装了~
conda install -c bioconda velocyto.py python=3
检查软件是否安装成功which velocyto
2. 运行流程
2.1 文件格式转换（bam to loom）
`velocyto run -u Gene -o ./ -e KO -v /XXX/06.RNA_velosity/input/i1.KO.bam /XXX/Database/refdata-gex-mm10-2020-A/genes/genes.gtf
参数信息
-u 用于保证UMI的唯一性，如果设置为Gene，则将GX 标签将附加到UB 标签
-o 结果目录，./表示在讲结果保存到当前目录
-e 设置的样本名称，将在loom文件中对每个记录添加上该信息，尽量短一些
-v 是否显示详细信息，-v (only warnings) -vv (warnings and info) -vvv (warnings, info and debug)
默认数据bam文件和gtf文件
如果想了解更多参数的信息，可以输出"velocyto run --help"进行查看` </pre>
2.2 合并loom文件（可选）
当多个样本在一起做分群的时候，需要执行这一步，如果是单个样本的RNA velocity则不需要进行loom文件的合并。
合并方法很简单，需要准备两个文件（1.python脚本；2.所需loom文件的路径），然后运行一个python脚本即可。
Tips：需要注意的是velocyto依赖python3，所以需要调用python3所在的路径
1. python脚本（merge.py）内容如下：
import loompy
files = []
inf = open("loom.file.list", "r")
for line in inf:
files.append(line.strip())
inf.close()
loompy.combine(files, "merged.loom", key="Accession")` </pre>
2. 所需loom文件的路径所需loom文件的路径都存放在loom.file.list文件中（如下图，每一行是一个loom文件的绝对路径）
最后把这两个文件放在用一个目录下运行即可：
/xxx/python merge.py
运行完成后就可以得到名为merged.loom的loom文件
运行完这两步以后，我们的准备文件就都得到啦。我们下期在具体讲讲在R中运行RNA velocity的流程~
