前面推文所提基本性质的分析（理化性质，基因染色体分布，基因结构、基序和保守结构域）已完成，进一步基因家族成员的进化分析可以推测未知基因的功能，也会让文章更为完整。进化分析包括1.基因家族成员的分类（进化树）2.物种内共线性分析（本人研究栽培花生，其分为A和B两个亚家族，可以研究A、B、A和B之间的关系）3.物种间共线性分析（栽培花生与模式植物拟南芥）

1.基因家族成员进化分析（进化树），如果基因家族成员数量不多，与基因结构，基序分布和保守结构域可以合成一张图，根据自己需要整合，因为本人研究较大，进化分析是单独做图。主要是2个部分A：氨基酸序列的比对与进化树的构建（MEGA软件）B：进化树的美化（ITOL网站http://itol2.embl.de/external.cgi）

A：氨基酸序列的比对与进化树的构建（MEGA7软件）：Align→Edit/Build Alignment→Create a new alignment→Protein→氨基酸序列拖入→Align by Muscle→Neighbor Joining→出现进化树（调整了相关参数并不是很满意图片的质量和效果，于是保存树文本文件，其他软件或者网站进行美化）→File→Export current tree（Newick）→ctrl+s→命名

B：进化树的美化（ITOL）

ITOL（最好进行用户注册，方便查看保存上传的文件）→Date uploaded→选择之前保存的树文本文件并命名→显示界面有basic/advanced/diaplay controls（根据需要自行调整，我对研究的基因家族成员整体进行颜色的分类和命名）→Export tree（根据需要选择保存格式）

进化树的构建与美化还需要与其他工作结合进行反复确认与修正（同一个亚家族成员基因结构、基序分布保守结构域是否一致，是否与其他物种该基因亚家族分类大致相似等）。

2.物种内共线性分析（搜索公众号“生信药丸”或“今日之森”讲解十分详细。栽培花生和栽培花生）：主要分为以下3个部分C：序列的比对D：文件的整理E：物种内的可视化

C：序列的比对：TBtools→BLAST→Two Sequences Files（参数自行调整，Outfmt为table）→Start（运行时间与物种基因组大小和相关参数设定有关，花生自身比对电脑运行了9 h左右，建议晚上电脑过夜）

D1：文件的整理（Advanced Circos需要2个文件图中1和3）：

（1） 染色体长度文件：自行编辑，文本格式保存

（2）Linked info文件：参考“今日之森”公众号中物种共线性推文（基因家族成员的数量少，自行编辑即可）

E1：种内的可视化：TBtools→Graphics→Advanced Circos

D2：文件的整理（Circle Gene View需要3个文件图中1、2和3）：

（1）基因组注释文件：原始的.gff3文件

（2）Gene Id List文件：（第一步确定家族成员已获得）

（3）Gene Linked info文件：：参考“今日之森”公众号中物种共线性推文（基因家族成员的数量少，自行编辑即可）

E2：物种内的可视化：TBtools→Graphics→Show Genes On Chromosomes→Circle Gene View

3.物种间共线性（栽培花生和拟南芥），与上述一致分为以下3个部分F：序列的比对G：文件的整理H：物种间的可视化

F：序列的比对：TBtools→BLAST→Two Sequences Files（参数自行调整，Outfmt为table）→Start（运行时间与物种基因组大小和参数设定有关，先花生比对到拟南芥，再拟南芥比对到花生，一次比对电脑运行了6.5 h左右）

G：文件的整理（总共4个文件整理后只有2个）：

(1)TBtools→Comparative Genomics→File Merge for MCScanX→花生和拟南芥分别的基因组注释文件拖入（.gff），Merge Mode改成GtfGff2SimGxf格式→得到文件1（花生和拟南芥整合的基因组注释文件）；

(2)TBtools→Comparative Genomics→File Merge for MCScanX→花生和拟南芥的分别双向比对的文件结果（blast.table），Merge Mode不变→得到文件2（花生和拟南芥的整合的双向比对的文件结果）。

(3)TBtools→Comparative Genomics→Quick Run MCScanX Wrapper→拖入文件1和2得到文件3（花生和拟南芥的共线性文件.collinearity）

H：物种间的可视化：TBtools→Comparative Genomics→Dual Synteny Plot→拖入4个文件（Block参数自行设置，我设置的30）→图片另存为（我一般选择pdf格式导入PS）

准备4个文件：

Ctl文件（陈程杰老师课程提供有相关模板，可自行编辑或搜索其他公众号的推文）

GFF文件：文件1

Collinearity文件：文件3

Gene List For Highlight：基因家族的ID List（第一步确定家族成员已获得）

以上就是基因家族成员进化关系的分析，对于成员数量较多的家族而言，工作量确实不小，文件格式经常出错，可视化图片没有显示等等，好在摸索后有比较好的结果，真诚的建议：多想，多找资料，多问，多做。