背景
目前市面上的肿瘤靶向用药基因检测Panel已非常常见，除了直观层面的gene种类、数目、捕获建库方法的不同外，对于肿瘤panel， 探针定制之初相关的MSI位点、融合断点等设计，直接影响着同一个Panel下每一批探针的实际检测效果。在探针设计层面，简单直接的办法就是确定gene列表后，直接外包探针定制公司代为设计或者自行在开源网站上设计优化:
优势:所有gene全外显子覆盖，简便高效；
弊端：对于中小型Panel，探针大小处于临界值的情况不容易控制；遗漏掉内含子区域的有害突变；外显子比例偏低的重要基因的CNV检测的准确性会受到影响；对于肿瘤用药检测Panel，MSI位点跟融合断点通常不在外显子区间中，需要额外补充；测序成本较高--以TMB相伴而生的大Panel为例，市面上500个gene左右的大Panel,若所有gene采用全外显子设计，探针大小普遍超过2Mb,在cfDNA样本低频突变要求的高深度测序模式下，即便10000X的原始测序深度，也需要20G以上的数据量，单测序费用就超过1000RMB，同时也延长了数据分析时间及交付周期。
为此，我们提出一种：结合Clinvar、COSMIC等数据库，对重点gene和非重点gene区别对待，以有害或可能有害突变分布密度为单位的选择性设计方案：
方法
具体步骤：
SNV/INDEL部分：
step1. 在Suredesign等软件上获取候选gene list对应基因组版本的外显子+3‘/5’UTR区间信息,同时根据用药、检测内容等信息确定候选gene list中的核心gene与非核心gene；
step2. 使用STIF、Polyphen2等主流突变有害性预测软件对COSMIC、Clinvar数据库中的全部位点进行注释，设定判断条件获得原始有害候选位点集合，进一步将候选集和按exon、UTR、intron等注释信息分类；
step3. 将step2得到的exon+UTR区域的有害位点信息mapping回step1得到的染色体区间，根据落入各区间的有害位点数目及区间长度得到有害位点分布密度；
step4. 结合step1确定的核心gene及非核心gene集合，设定对应的有害位点分布密度cutoff值，确定需要保留exon+UTR区域后，再引入intron等区域的有害位点；
CNV部分：
结合step1确定的gene exon区间总长、NCBI等数据库收录的gene全长信息，计算该gene全外显子区域占比，若比例过低，则需随机引入内含子区间作为补充，如果有文献明确报道其CNV区域，也可直接引入文献报道区间。
融合/微卫星部分：
融合断点以及微卫星位点一般都不在exon区域，需要结合文献、数据库及同行同类产品收集整理并引入。
汇总迭代：
合并SNV/INDEL、CNV、融合/微卫星部分的基因组位置信息，结合探针区间的目的大小，迭代优化。
查遗：
1. 在终版探针定出之前，对TERT基因 promoter等特殊位点以及EGFR靶向用药相关突变、FGFR融合断点等重要位点进行查遗确认。
升级：
对于大panel： 如果对TMB与WES的相关性更关注，可以进一步根据目的癌种的不同，从SNV/INDEL的区间中迭代计算，选取与目的癌种spearman相关系数最高的区间，作为TMB计算的候选区域。
***注意软件版本及参数更新对默认区间的影响：以AKT1基因为例：
原因：2020年7月份上线的基于机器学习方法进行探针区间优化的“Select Optimized Probes” 默认参数，对AKT1基因来讲，虽然可以减少34%的探针数目和24%的区间，有效降低了探针合成与定制成本，但这个功能目前是存在bug的，会遗遗漏exon末端区间，而有些是包含重要用药信位点的，导致下一步用默认的“Coding Exons”参数却并不是真正的外显子设计！
解决办法：
1.需要控制区间大小——上一步改回原来的“Design new probes by tiling genes or regions”参数；
2. 关注UTR区域——选择Coding Exons + UTRs参数;
3. 在探针定出后发现bug——适当延长原bed文件中每个外显子的上下游区间，以回收部分遗漏区域。
建议每批探针设计完成后，随机挑选重要基因或重要区域，在UCSC上加一步确认，以避免因更新优化引入的新bug！
讨论
1.市面上各家肿瘤基因检测公司的产品，尤其是拼基因数目的大Panel，有多少是真正的所有gene全外显子设计？
2、对肿瘤患者及药企伴随诊断而言，所有gene外显子全部引入的设计模式性价比？
