鉴定好细胞类型后，我们还可以对其进行一些功能性分析，如拟时序分析和SCENIC分析，对细胞的生物学意义进行一定程度上的挖掘。本期小编主要为大家介绍拟时序分析（Pseudotime Analysis）。
1****、Q**** & ****A环节
Q****1****：我们为什么要进行拟时序分析？？
l 机体为响应各种应激，其细胞会从一种功能“状态”转变为另一种功能“状态”；
l 当细胞在不同状态之间转变时，往往会经历转录重组，导致一些基因被沉默，一些基因被重新激活，但纯化这些瞬态细胞进行研究是很困难或不可能的；
l ScRNA-seq拟时序分析可以让我们在不需要纯化的情况下查看这些细胞状态。
Q****2****：Sc****RNA-seq****拟时序分析是什么？？
拟时序分析，即根据不同细胞亚群基因表达量随时间的变化情况，构建细胞谱系发育，但这里的时间并不是真时间，而是一个虚拟的时间，是指的细胞与细胞之间的转化和演替的顺序和轨迹。
l 即使在同一个样本中，也会存在多种不同的细胞形态。因此，不论测定了多少样本，我们都可以采用拟时序分析对样本中的细胞转化和变化进行描述。
Q****3****：拟时序分析用的工具是啥？它能进行哪些分析？
l Monocle是用于ScRNA-seq拟时序分析的经典工具（R包），目前已更新至3版本；
l Monocle是使用算法来学习细胞状态转变过程中每个细胞必须经历的基因表达变化序列，一旦了解了基因表达变化的整体“轨迹”，Monocle就可以将每个细胞放置在轨迹中的适当位置。
l 我们可以使用Monocle中的相关分析工具做Beam分析（Branch Expression Analysis Modeling），揭示重要的基因和细胞。
（算法参考文献：Reversed graph embedding resolves complex single-cell trajectories.）
2、拟时序分析工作流搭建 略
3、拟时序分析结果解读
对于拟时序分析来说，研究某一特定细胞类型的转化，如M1/M2型巨噬细胞极化、CD8+ T细胞激活和耗竭等等，往往具有一定的生物学意义。这里小编通过对上期T细胞进行亚群鉴定，以CD8+ T细胞亚型为例进行拟时序分析（图1）。
图1 CD8+ T细胞亚群鉴定流程
（1）CD****8****+****T细胞树形结构轨迹
图2 CD8+ T细胞树形结构轨迹
图中每个点代表一个细胞，具有相似状态的细胞被聚到一起，每个分支点代表一个可能的细胞生物学过程决策点（该例图中只有1个分支点）。图2展示了CD8+ T细胞每个cluster在伪时间轴上的分布，不同颜色代表不同cluster。我们这边通过对每个cluster进行细胞类型鉴定，初步将cluster 2/3/6鉴定为记忆T细胞，cluster 7鉴定为Naïve T细胞。
（2）CD****8****+****T细胞所处分化时间轨迹
Monocle基于离默认伪时间轴起点的远近，将细胞排布如图3所示。在该图中颜色越深代表默认的起点，颜色越浅表示离伪时间轴起点越远。注意：这边的起点是monocle算法计算出来的，而非实际真正的起点。
图3 CD8+ T细胞所处分化时间的轨迹图
以该例图为例，我们结合每个分支（共3个分支）中的cluster类群是否高表达CD8+ Naïve T细胞相关Marker（如LEF1、SELL和CCR7等）, 耗竭性T细胞相关Marker（如LAG3、HAVCR2、CD27、TIGIT等），以及细胞增殖相关Marker（如MKI67、TOP2A、CCNB1等），将起始状态鉴定为Naïve T细胞，终末状态为耗竭性（Cell fate 1）和增殖型（Cell fate 2）T细胞。
（3）Beam分析
确定了分化起点后，Monocle可以模拟出每个细胞所处的分化时间，并寻找随着分化时间逐渐升高或降低的基因表达热图和分布图，即Beam分析。图4将Top200差异基因聚成4类，展示了pre-branch向cell fate1和cell fate2状态分化相关的命运决定基因。图5展示了与细胞增殖相关的基因，如MKI67和TOP2A在cluster 5中高表达，提示cluster 5作为CD8+ Naïve T细胞终末分化状态是一种增殖型细胞（Proliferating）。除此之外，如果有特别关注的基因也可以基于关注的基因进行绘制。
图4 拟时序Beam分析基因表达热图
图5 拟时序Beam分析基因表达分布图
总的来说，通过对CD8+T细胞亚型进行拟时序分析得到了CD8+ T细胞的分化轨迹，进行Beam分析可以帮助得到与状态分化相关的命运决定基因
