1. Author
Paul Bieniasz试图探寻宿主基因和途径如何影响逆转录病毒的复制，比如HIV-1。Bieniasz和他的团队主要关注人类和灵长类免疫缺陷病毒，致力于确定病毒基因和蛋白质的功能，并表征逆转录病毒模拟和操纵的宿主功能。他们还研究了从古代到现代宿主细胞对逆转录病毒感染的分子防御机制。此外，该团队正在努力开发更有用的艾滋病病毒感染模型，以改进对新形式治疗和疫苗接种。
2. Background
2.1 体细胞突变（somatic mutation）
B细胞产生多样化的抗体的机制主要有两个。一个是重组激活基因（RAG）编码的重组酶等主导的基因重排；另一个是胞苷脱氨酶（AID）等主导的体细胞高频突变（SHM）。胞苷脱氨酶不光参与了体细胞的高频突变，同时也参与了抗体的类别转化，当然体细胞的高频突变发生在抗体的类别转化之后。以抗体的类别转化（isotype switching）为例，在Th细胞的信号刺激下，胚系基因的转录组就会启动转录，生成的mRNA结合在靶基因上，形成R-loop结构（DNA-RNA-DNA）。游离的单链被AID识别并发生催化，使C变成U。紧接着在UNG的作用下脱U并在APE1作用下切割形成缺口。此时R-loop中的mRNA游离，本来作为模板链的DNA链也被酶解。机体以此方式造成了DNA的双链断裂，使DNA的重拍以及基因高频突变成为可能。VDJ区域的重拍也是这个原理。值得一提的是，辅助性T细胞更倾向于与亲和力高的BCR结合，这样使得这些B细胞更有可能增殖进而获得生长优势。
2.2 RBD抗体的分类
SARS-CoV-2病毒的表面刺突蛋白（Spike）由三个相同的单体构成三聚体。三个受体结合结构域（RBD）位于每个刺突蛋白的尖端。一个RBD可以从刺突蛋白的 “向下（down）”位置翻转到 “向上（up）”位置，从而暴露了一个称为受体结合基序（receptor-bindingmotif，RBM）的隐藏位点。RBM负责病毒与宿主细胞ACE2受体的初步结合，起始病毒进入细胞。RBD特异性单克隆抗体可以阻断RBM—ACE2的相互作用，是ACE2的阻断剂。
根据RBD的位置（向上或者向下）可以将Spike蛋白在宿主细胞内区分为不同的构象。对应地根据中和性抗体与RBD不同的表位识别与结合模式，可以将其划分为4种（I, II, III, and IV）类型。Class I中和抗体只能够结合“向上”的RBD；Class II中和抗体 及Class III 中和抗体可以识别"向上或者向下"的RBDs。其中，I类及II类中和抗体可以阻断RBM与ACE2的结合，III类中和抗体除了可以阻断ACE2结合位点也可以与相邻的RBD前聚体相互作用。Class IV 中和抗体除可以结合RBD的保守区域(核心I区域）或者仅为“向上”的RBD(核心II区域）。其中IV类核心I区域依赖的中和抗体除对SARS-CoV-2及其变体和其他相关冠状病毒具有广泛的中和活性。
3. Methods
1. 单克隆抗体
2. SARS-CoV-2假病毒中和实验
4.抗抗体rVSV/SARS-CoV-2变种的选择
5. rVSV/SARS-CoV-2中和试验
6. 序列分析
7. 亲和力测定
8. 蛋白表达和纯化
9. 冷冻电镜结构解析
10. X-射线结构分析
空斑纯化
1. 将病毒原液在PBS中梯度稀释10倍，并将每次稀释液300μl施加到在6孔板中铺板的MDCK细胞，30min
2. 丢弃残留的培养基并用PBS洗涤细胞2次。然后在细胞上加入2ml覆盖培养基（DMEM+2%FBS+0.9%BactoTM琼脂），培养2-3天以观察斑块。
3. 1 ml移液管尖端从顶部拾取一块斑块，然后在4°C下将斑块重悬在1 ml PBS中16小时。
#这1 ml含有病毒的PBS将用作第一轮斑块，第二次重复斑块纯化。
4. 对产生的病毒进行测序，并在75 cm烧瓶中的MDCK细胞中繁殖以制备病毒原液。
4. Results
作者团队选取了1072个确诊为中度或者重度的康复患者的1个月和6个月的RBD中和抗体。并选取了6个代表性家族的14个抗体。在这些抗体中，Ⅱ类抗体占据大多数，同时作者团队还做了BLI来表征抗体与病毒的相互作用。值得一提的是，实验团队利用能够自主复制的嵌合疱疹性口炎病毒(VSV)来确定每种抗体的无法中和的变异株，即逃逸变异株。
就家族Ⅱ的IGHV3-53+ IGLV2-14而言，1个月诱导产生的C144抗体与6个月诱导的C051/C052相比，具有L455/F456/E484/F490/Q493/S494突变的变异株可以对C144产生逃逸；C051/C052则有所不同，Q493R的突变体仍然可以被C051/C052中和但E484K的突变株产生了逃逸，这个突变位点同样可以逃逸C144。
另一组属于家族Ⅱ的抗体——IGHV3-66+IGLV2-33而言，一个月诱导产生的C143/C164与6个月产生C055相比，C143/C164拥有者弱中和能力，但是同之前的IGHV3-53+ IGLV2-14相比：①体细胞突变率（SHM）较高， C055的SHM更高。②IGHV3-53+IGLV2-14逃逸的E484K这个位点在这个群里中被有效的抑制了。但是G485K，F486S/V能够有效的逃逸这个群体。
最后一个家族是IGHV1-69+IGLV9-49。其中C548是1个月诱导产生的抗体，C549为6个月诱导产生的抗体。就SHM而言C548与胚系基因相比只有1个核苷酸的不同，C549也只有大概20个左右的不同。其次E484K与Q493R突变株可以对C548进行逃逸。而这种逃逸在C549中也存在，但程度有所减弱。值得一提的是实验团队发现SHM使得突变株对C549的逃逸格外困难，需要拥有两个以上的突变位点，例如Y449H/E484K与F486L/F490P。
RBDⅠ家族抗体中IGHV353/IGLV3-20编码的抗体也存在差异——1个月诱导产生的C098与6个月诱导产生的C099。C099对变异株的亲和力高于C098，并且C099而言，D420Y/N460H与L455R/Y453H的双突变可以有效的逃逸C099的中和作用。同理RBDⅢ家族抗体中IGHV4-4/IHLV2-14编码的C132与C512也有明显的差异。C512对WT和R346S 变异株有着良好的亲和力。但是被R346, K444, 或 G446逃逸。有趣的是，尽管C132的效力很差，但是可以亲和K444，被R346逃逸。C512则被K444逃逸但亲和R346。
上述的目光聚焦在抗体上，紧接着作者以B1.351，即β株（突变位点为：E484K K417N N501Y）为实验对象，进行了研究。RBDⅡ家族的抗体全部被β株逃逸，但是经过SHM之后的抗体C055、C549与毒株的亲和力有所上升。RBDⅠ与Ⅲ的抗体不被β株影响，依旧拥有较高的亲和力。除了β变异株意，SARS-CoV-2引发的抗体成熟可产生对抗其他sarcov病毒的活性。
作者团队通过解析SARS-CoV-2-
Spike与结1类(C098/C099)和2类(C144/C051)抗体Fab片段的结构，说明了体细胞突变对抗体抗原相互作用的影响。在这些结构中，感染后6.2个月发现的大多数突变发生在互补决定区(CDR)环。以shape complementarity（SC）指数来评估（其变化范围从不匹配0到完美匹配1），SC指数在0.64-0.68。
Ⅰ类抗体：对于C098和C099，大多数RBD接触是由CDR1和CDR2 V基因编码区域介导的。099的CDRH1和CDRH2的体细胞突变促进了结合和中和特性。例如，在C099中发现的F27I突变引入了一个更小的疏水残基，这可能使CDRH1环更灵活，促进了该区域的极性接触和范德华相互作用。在CDRH2中， S53A和Y58F去除了RBD界面上的极性接触。Y58F被认为在增加结合中起到了至关重要的作用。
Ⅱ类抗体：与C144一样，C051抗体重链介导了大部分RBD作用。RBD位点L455、F456、E484和Q493的突变能够脱离C144，而只有E484K突变能够脱离C051。病毒在RBD位置L455和Q493的逃逸是由精氨酸执行的，因为精氨酸的取代会破坏C144-RBD界面上的氢键。此外，C051的CDRH3 E97D体细胞突变引入了一个较小的荷电残基，可能更好地适应该区域的精氨酸侧链。
紧接着作者团队进一步去分析2/3类RBD抗体的逃逸机制：
①C548是由VH1-69 VH基因片段编码的，该片段编码CDRH2末端的疏水序列，该序列已被证明可以促进对流感、丙型肝炎和HIV-1的广泛中和作用。C548 残基I53-F54靶向N343附近的RBD核心中的疏水中心，包括RBD残基W436、N440和L441。C549之所以能够避免逃逸是因为轻链的体细胞高频突变：30Y与RBB的残基F490形成反作用，而27D和92E则分别增加了与RBD侧链N450和主链F449的极性接触。
②C032识别一个糖肽表位，该表位集中在RBD核心的一个短螺旋段上，该螺旋段位于N343 -聚糖附近的437 – 442残基上。在CDRH3末端，疏水残基HC A97、HC V98和HC W100被埋进由344-348和443-450残基组成的RBD环形成的口袋中。
③C080中的大部分体细胞突变位于Fab-RBD界面的远端。C080体细胞突变可能会影响抗原界面和CDR环构象和灵活性。C080体细胞突变HC I31和LC F33分别与RBD残基444-445和346直接相互作用，预计CDRL3突变可间接促进SARS-CoV RBD的识别。
5. Discussion
作者：Paul D.Bieniasz 单位：TheRockefeller University
年份：2021.8.10 期刊：Cell immunity
科学问题：随着时间的推移，体细胞高频突变是否可以影响抗体的效力与广谱程度
结论：通常，在6.2个月时分离出的抗体比在1.3个月时分离出的克隆亲属的效力更高。一个例外是C144。结构分析表明，C144的高效与它将S三聚体锁定在预融合封闭状态的能力有关。与1.3个月的抗体相比，被选择的突变具有对6.2个月抗体的抗性。一些6.2个月抗体的显著特征包括限制病毒逃逸的选择范围，以及在面对1.3个月抗体逃逸的点突变时保持中和活性。在某些情况下，rVSV/SARS-CoV-2的选择实验表明，体细胞突变提高了抗体抗性的遗传屏障，要求至少进行2次替换才能避免中和。RBD三突变体K417N/E484K/ N501Y通常不会对尚未受E484K突变影响的抗体产生耐药性。只有E484K突变会产生更普遍的2类抗体抗性。包括一些成熟的抗体(如C051, C052)。
