一、相似度Similarity
序列的分析离不开相似度这个指标，相似度比较高的序列往往具有相似的结构、执行相似的功能。所以用未知序列blast得到的结果可以对未知序列进行推测。
当两个序列非常相似时，生物学家称之为同源。然而有一点不明确，就是什么程度的相似可以称之为“非常”相似呢？书上说一般长度为100以上核苷酸序列或者氨基酸序列，序列之间的一致度（identical）大于70%（nt）或25%（aa）可以推测同源。
不过有时，一致度或相似度很高的两个序列也有可能非同源，这种进化上的“趋同”现象可能是随机产生的，这样的一对序列可称为同功序列。或者序列相似度很低，但是蛋白质三维结构几乎一样的情况也有。分析的时候还要结合E-value，两序列中可对应的序列长度占两序列的比例，插入和删除的残基个数等一起判断是否是同源。推荐阅读往期推送【现学现卖】序列比对之identity VS similarity，【现学现卖】序列比对之bit-score VS E-value。
二、最棒的序列比对工具没有之一——BLAST
之前第六章主要介绍了分析一条氨基酸序列理化性质，结构域的方法。这章说说序列比对，比对就不得不用BLAST。NCBI中蛋白质相关的blast有：blastp（用氨基酸序列在氨基酸数据库中比对），tblastn（用氨基酸序列在核苷酸数据库中比对）。
1. NCBI-blastp
https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome
以序列号P09405的氨基酸序列为例进行blastp。
很快返回结果页面，点击按钮可以展开一些折叠的结果，还有filter工具筛选你感兴趣的东西。
上图标记黄色的都可以点开看看，比如Graphic Summary打开后如下图。彩色部分展示的是数据库中得到的序列与查询序列（query sequence）比对的位置，不同的颜色体现相似程度/得分。前面的几个序列与查询序列匹配程度很高，后面短的粉色部分的信息也并不是没有用处，比如可以帮助我们找到蛋白质结构域。
在Alignments里，上方是查询序列，下方是匹配序列，中间那栏，如果是字母则表示匹配，如果是➕表示是相似氨基酸残基，如果是空则表示未匹配上。
2. NCBI-blastn
BLASTing DNA序列和蛋白质序列很类似，而且如果你知道DNA序列的ORF，可以翻译成氨基酸序列使用blastp，获得更加准确的结果。
DNA序列比对可用blastn，还有tblastx和blastx，这里面的t表示translated，就是你输入DNA序列，在blast之前会有工具将其翻译，再进行blast比对。tblastx数据库是TDNA数据库（系统将nt翻译为aa的一个数据库），blastx数据库是氨基酸序列库。至于不同情况用什么工具，见下图。
3. 用BLAST方式思考问题（一些BLAST可以解决的问题）
（1）在基因组中寻找目标基因
可以将基因组分为多条两端互相重叠的序列（2-5kb），然后用blastx在NR库（the Non Redundant protein database）中检索。
（2）预测蛋白质功能
用blastp在Swiss-Prot数据库中检索，你输入的蛋白序列可能拥有和高分结果相似的功能。
（3）预测蛋白质三级结构
用blastp在PDB数据库中检索，道理同（2）
4. 使用BLAST前可以设定的参数
一般情况下进行BLAST，会对organism进行限定，其他参数维持默认。那么什么情况下需要修改默认参数呢？比如没有返回结果或者结果的E-value数值大，可以更改矩阵或空位罚分；或者返回太多结果，则可以限定所使用的数据库、关键词、E值等。
（1）blastp
一些蛋白质序列的某一部分复杂程度比较低（low-complexity/ low-entropy），一种或几种氨基酸残基在一段区域内富集。这样两个序列比对会产生高分结果，但是它们很可能毫不相干。为了避免这个问题，可以勾选Algorithm parameters——filters and mask高级选项——“low complexity regions”，过滤这样的比对结果。
（2）blastn
对于DNA序列，限定的参数页面如下，其中word size是指开始一段比对的序列长度，size越大，比对速度越快、精度越低。
三、PSI-BLAST简单介绍
在blastp下方算法选择里，还有PSI-BLAST。即Position-Specific Iterated BLAST，位点特异性迭代BLAST。
先BLAST 到一系列相似序列，并对其中每一个位置上的元素构建PSSM矩阵。继续进行第二轮blast，再加上新搜索出来的序列结果构建新的PSSM矩阵。这样迭代，直到无法搜索出新的结果为止或者直到获得了足够的序列为止。
BLAST的结果都是相近序列，使用PSI-BLAST可以帮助我们找到远缘序列。
其他操作和BLAST类似，点击BLAST返回结果页面如下。
然后可以点击Run PSI-Blast iteration 2开始迭代，直到没有新的序列产生或产生的序列数目满意为止。迭代产生的序列，系统会自动标黄。
这里需要解释一下，如果选择了这条序列构建PSSM矩阵，那么迭代之后，序列后面会有绿色圆形对勾，如果像我这次没有勾选（荧光黄色的4条序列），则这些序列不参与构建矩阵。实际操作时，如果第N次迭代新增加的序列结果明显不对，则不勾选它构建矩阵，剩下的序列构建的矩阵进行下一次分析。
当输入的查询蛋白质序列包含多个结构域时，输出结果可能不太可信。因为很多八竿子打不着的蛋白质也会有相似结构域。这时候可以根据第六章里面寻找结构域的方法，找到结构域的位置，将长蛋白质序列根据结构域分割为片段，进行blast。这种分割分析也适用于大于200aa的蛋白质序列。
往期相关内容：
【陪你学·生信】五、当你有一段待分析的DNA序列（基础操作介绍）
【陪你学·生信】六、当你有一段待分析的氨基酸序列（基础操作介绍）
