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往期回顾:

• 使用ArchR分析单细胞ATAC-seq数据(第一章)
• 使用ArchR分析单细胞ATAC-seq数据(第二章)
• 使用ArchR分析单细胞ATAC-seq数据(第三章)
• 使用ArchR分析单细胞ATAC-seq数据(第四章)
• 使用ArchR分析单细胞ATAC-seq数据(第五章)
• 使用ArchR分析单细胞ATAC-seq数据(第六章)
• 使用ArchR分析单细胞ATAC-seq数据(第七章)
• 使用ArchR分析单细胞ATAC-seq数据(第八章)
• 使用ArchR分析单细胞ATAC-seq数据(第九章)
• 使用ArchR分析单细胞ATAC-seq数据(第十章)

第11章: 使用ArchR鉴定标记Peak

在讨论基因得分(gene score)这一章中，我们已经介绍了标记特征的鉴定。相同的函数getMakerFeatures()也能够用于从ArchRProject任意矩阵中鉴定标记特征。所谓的标记特征指的是相对于其他细胞分组唯一的特征。这些特征能帮助我们理解类群或者细胞类型特异的生物学现象。在这一章中，我们会讨论如何使用该功能鉴定标记peak。

11.1: 使用ArchR鉴定标记Peak

通常而言，我们想知道哪些peak是某个聚类或者某一些聚类所特有的。在ArchR中，这可以通过设置addMarkFeatures()函数的useMatrix="PeakMatrix"来实现（无需监督）。

首先，我们需要再看一眼projHeme5中有哪些细胞类型，以及它们的相对比例

table(projHeme5$Cluster2)

现在，让我们调用getMarkerFeatures参数，并设置useMatrix="PeakMatrix". 此外，为了降低不同细胞组之间的数据质量对结果的影响，我们可以设置bias参数，其中bias = c("TSSEnrichment", "log10(nFrags)")就是用来避免TSS富集和每个细胞的fragment数对结果的影响。

markersPeaks <- getMarkerFeatures(
    ArchRProj = projHeme5, 
    useMatrix = "PeakMatrix", 
    groupBy = "Clusters2",
  bias = c("TSSEnrichment", "log10(nFrags)"),
  testMethod = "wilcoxon"
)

getMarkerFeatures()函数返回一个SummarizedExperiment对象，该对象包含一些不同的assays

markerPeaks

接着，我们可以用getMarkers函数从输出的SummarizedExperiment对象中提取我们感兴趣的部分。默认情况下，它会返回一个包含多个DataFrame的列表，不同的DataFrame表示来自不同的细胞分组。

markerList <- getMarkers(markersPeaks, cutOff = "FDR <= 0.01 & Log2FC >= 1")
markerList

如果我们对特定的一个细胞分组感兴趣，我们可以用$进行提取。

markerList$Erythroid

除了返回一个包含多个DataFrame的列表外，我们还可以用getMarkers()返回一个GRangesList，只要设置returnGR=TRUE即可。

markerList <- getMarkers(markersPeaks, cutOff = "FDR <= 0.01 & Log2FC >= 1", returnGR = TRUE)
markerList

这个GRangesList同样可以用$提取特定细胞组的结果，返回的是一个GRanges对象

markerList$Erythroid

11.2 在ArchR中绘制Marker Peaks

ArchR提供了许多绘图函数用于getMarkerfeatuers()返回的SummarizedExperiment对象的可视化。

11.2.1 Marker Peak Heatmap

markerHeatmap能以热图的形式展示标记Marker Peak（或者其他getMarkerFeatures()输出的特征）

heatmapPeaks <- markerHeatmap(
  seMarker = markersPeaks, 
  cutOff = "FDR <= 0.1 & Log2FC >= 0.5",
  transpose = TRUE
)

使用draw函数绘制结果

plotPDF(heatmapPeaks, name = "Peak-Marker-Heatmap", width = 8, height = 6, ArchRProj = projHeme5, addDOC = FALSE)

Marker Peak Heatmap

plotFDF()函数能够以可编辑的矢量版本保存图片

plotPDF(heatmapPeaks, name = "Peak-Marker-Heatmap", width = 8, height = 6, ArchRProj = projHeme5, addDOC = FALSE)

11.2.2 Marker Peak MA和火山图

除了绘制热图，我们也可以为每个细胞分组绘制MA或者火山图(volcano)。这些图可以用markerPlot()函数绘制。对于MA图，需要设置参数plotAs="MA". 我们以"Erythroid"细胞分组为例，设置参数name = "Erythroid"

pma <- markerPlot(seMarker = markersPeaks, name = "Erythroid", cutOff = "FDR <= 0.1 & Log2FC >= 1", plotAs = "MA")
pma

iMA图

同样的，只要设置plotAs="Volcano"就可以绘制火山图

pv <- markerPlot(seMarker = markersPeaks, name = "Erythroid", cutOff = "FDR <= 0.1 & Log2FC >= 1", plotAs = "Volcano")
pv

volcano plot

plotFDF()函数能够以可编辑的矢量版本保存图片。

plotPDF(pma, pv, name = "Erythroid-Markers-MA-Volcano", width = 5, height = 5, ArchRProj = projHeme5, addDOC = FALSE)

11.2.3 Browser Tracks的Marker Peak

此外，我们在基因组浏览器上检查这些peak区域，只需要为plotBrowserTrack()函数的features参数传入 相应的peak区间。这会额外在我们的ArchR track图的下方以BED形式展示marker peak区域。

p <- plotBrowserTrack(
    ArchRProj = projHeme5, 
    groupBy = "Clusters2", 
    geneSymbol = c("GATA1"),
    features =  getMarkers(markersPeaks, cutOff = "FDR <= 0.1 & Log2FC >= 1", returnGR = TRUE)["Erythroid"],
    upstream = 50000,
    downstream = 50000
)

我们使用grid::grid.draw()绘制结果

grid::grid.newpage()
grid::grid.draw(p$GATA1)

browser track

plotFDF()函数能够以可编辑的矢量版本保存图片。

plotPDF(p, name = "Plot-Tracks-With-Features", width = 5, height = 5, ArchRProj = projHeme5, addDOC = FALSE)

11.3 组间配对检验

标记特征鉴定是一种特别的差异表达检验。此外，使用相同的getMarkerFeatures()函数也能实现标准化的差异分析。我们只需要设置useGroup为一组细胞，然后设置bgdGroup为另一组细胞即可。这就可以对给定两组进行差异分析。在这些差异分析中，在useGroups比较高的peak的倍数变化值是正数，在bgdGroups比较高的peak则是由负的倍数变化值。

这里，我们对"Erythroid"与"Progenitor"细胞组进行配对检验。

markerTest <- getMarkerFeatures(
  ArchRProj = projHeme5, 
  useMatrix = "PeakMatrix",
  groupBy = "Clusters2",
  testMethod = "wilcoxon",
  bias = c("TSSEnrichment", "log10(nFrags)"),
  useGroups = "Erythroid",
  bgdGroups = "Progenitor"
)

使用markerPlot()函数可以绘制MA或者火山图。MA图需要设置plotAs="MA"

pma <- markerPlot(seMarker = markerTest, name = "Erythroid", cutOff = "FDR <= 0.1 & abs(Log2FC) >= 1", plotAs = "MA")
pma

group marker peak MA plot

火山图需要设置plotAs="Volcano"

pv <- markerPlot(seMarker = markerTest, name = "Erythroid", cutOff = "FDR <= 0.1 & abs(Log2FC) >= 1", plotAs = "Volcano")
pv

group marker peak volcano

plotFDF()函数能够以可编辑的矢量版本保存图片。

plotPDF(pma, pv, name = "Erythroid-vs-Progenitor-Markers-MA-Volcano", width = 5, height = 5, ArchRProj = projHeme5, addDOC = FALSE)

在后续章节中，我们还会进行差异分析，因为会在我们的差异开放的peak中搜索富集的motif。