首先解释一下，为什么要分析灰度值？

灰度的概念是使用黑色调表示物体，即用黑色为基准色，不同的饱和度的黑色来显示图像。采用ECL发光时，蛋白条带发出的荧光会曝光在胶片上，留下的黑色条带。然而胶片扫描后为蓝色背景、黑色条带，这并不是单纯的黑灰白颜色。因此，我们首先得在Photoshop中将整张图片去色，使彩色图片变成黑白图片，形成近灰色背景、黑色条带的图片类型。此时，条带的深浅和面积综合代表着蛋白的量。灰度值分析自然就成为我们的首选。

延伸说一下，免疫组织化学染色(IHC)结果本身为近白色背景、棕黄色阳性表达，这时我们就不能直接用灰度反映阳性表达强弱了，而是积分吸光度，也就是咱们常说的平均光密度(IOD)。如果你真的想用灰度计算IHC结果，显然你需要将图片转为灰度图再计算。此处不表。

分析图文步骤如下：

Image J软件界面 ↓

1. 图片转换为黑白图：

首先使用Photoshop打开胶片扫描图片，点击“图像>调整>去色”，将彩色图片转化为黑白图片，并使用裁剪工具将目标条带裁剪至合适大小后另存图片。

2.打开Image J软件：

2.1.打开图片文件：File>Open；将图片转化为8bit类型：Image>Type>8-bit。

(此步骤的目的是为了将图片的每个像素用8bit表示，这样的话，整个图片的灰度将分为256个级别，即黑、灰、白的像素模式；若保留原始的16bit格式或RGB格式，图片灰度级别会呈指数增长，并有其它颜色混入，造成计算误差。)

2.2.将整张图片背景灰度均一化，消除图片背景影响：

Process>Subtract Background，默认数值为50即可。

2.3将图片黑白颜色反转。

使背景为黑色而条带为白色。既还原了条带发光时的样子，也方便我们后面圈选条带：Edit>Invert。

2.4设置从测量指标：

Analyze>Set Measurements，选择Area面积、平均灰度值Mean gray value、积分灰度值Integrated dendity。

(解释一下，我们最终要使用的值为积分灰度Integrated dendity，而不是平均密度值Mean gray value。因为平均灰度仅是选定区域的平均灰度数值，而积分密度值则加权了平均灰度和选定的面积，这样选择就消除了选定面积大小对灰度值的影响。希望大家能好好理解这一概念，未来小编讲到IHC测量时将详细说明。)

2.5设置测量单位为“单个像素”：

Analyze>Set Scale，将Unit of length中的inch改为pixels。

2.6选定需要测量的条带，并测量积分光密度：

使用矩形选框、椭圆形选框或手动绘制选框(手残党勿用)，将面积最大的条带完全圈住，快捷键Ctrl+m测量，弹出Results结果框，结果中的IntDen即积分灰度值；继续左键点击选定框中间，不要点框线(否则选定框的大小会改变，要保证框选范围一致)，拖动选定框并移动至其它条带，快捷键Ctrl+m测量；重复操作至所有条带测完，最后不要忘了在图片无条带位置加测背景的灰度。

2.7测量结束后，点击Results框中的Edit，选择Select All，粘贴至Excel，开始下一步的分析。

2.8积分灰度值的计算和标准化

首先，将所有条带的IntDen都减去图片背景的IntDen，以扣除背景影响；然后用目标蛋白的灰度值除以其对应泳道的内参照条带灰度值，以此作为该组的目标蛋白相对表达量A。

标准化方法1：如果你是用一张膜来统计，那么直接用所有组的A值除以对照组A值，此时对照组结果为1，其它组结果为对照组的倍数，以此做均一化。

标准化方法2：如果你是用2张或以上的膜来一起统计，那么首先计算所有膜上的对照组A的平均值A’，然后用其它组的A值除以A’，以此做均一化。这种方法的前提是不同膜之间的背景颜色要相近，若偏差大则数据会很乱。

事实上，还有一种采用波峰下面积分析条带的方法。即通过半自动描绘电泳条带的等高线边缘来得到等高线区域内部面积，再将该面积乘以区域内平均光密度值得到条带内部总的信号量。这种计算方法可在Image J或者Quantity One上实现。但是有人注意到此法的缺陷，故小编没有具体说明这种测量方法。附上链接，有兴趣的同志们可以看看。

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