来源：http://blog.sciencenet.cn/blog-3431904-1251930.html

已有 6251 次阅读 2020-9-24 17:25 |系统分类:科研笔记

23.png

锁核酸（LNA）是一种含有桥接双环糖基（bridged, bicyclic sugar moiety）的合成核酸类似物。

在2'-O-和4'-位之间添加的亚甲基基团将呋喃核糖环“锁定”为3'-内构象（3'-endo conformation）。这种构象形成了A型RNA的特征结构。由于这种双环糖骨架的限制，LNA只会形成A型双链体。此外，LNA完全遵守Watson-Crick的碱基配对原则。因此LNA:DNA杂交双链体可以由序列互补的DNA和LNA自发形成，并且研究发现，LNA:DNA杂交体与其对应的DNA:DNA相比，其退火温度会大幅度升高。由于LNA的合成与标准寡核苷酸合成相容，因此可以直接将单个或多个LNA核苷酸位点选择性地掺入DNA序列中。这些含有LNA的寡核苷酸与它们互补的DNA序列退火后形成嵌合LNA:DNA杂交体。这些杂交体也均为A 型构象，并且与相应的DNA:DNA双链相比，Tm值也会显著升高。粗略估算，DNA引物（<30 nt）中每掺入一个LNA核苷酸可使Tm值增加3-8℃。总而言之，LNA的主要优点在于其可对所需寡核苷酸的Tm值进行微调，从而成为引物和探针设计时的选择。由于结合亲和力更强，所以可以合成更短的探针，同时其对目的DNA的结合特异性也更强。因此，推荐将 LNA 用于需要高特异性和/或可重复性的任何杂交检测，例如PCR引物、双标记探针、原位杂交探针和分子信标。此外，由于相同的原因，LNA 修饰的寡核苷酸也可以成为反义药物开发的一种理想的候选物。

21.png

增强对单核苷酸的识别

掺入LNA 核苷酸后，由于LNA在错配位点形成Watson-Crick碱基对的倾向更强烈，因此qPCR 探针通过单核苷酸多态性（SNP）区分等位基因的能力会大大增强（Johnson et al., 2004）。热变性研究表明，当LNA 掺入在寡核苷酸的特定位置时，完美匹配和错配之间的 Tm 值存在显著差异。因此，在 SNP 测定中，与天然状态DNA探针相比，LNA qPCR探针杂交具有更强的不稳定性，因此能够更好地区分出错配。

Johnson, M. P.; Haupt, L. M.; Grifiths, L. R. Locked nucleic acid (LNA) single nucleotide polymorphism (SNP) genotype analysis and validation using real-time PCR. Nucleic acids research 2004, 32 (6), e55.

22.png

Influence of LNA on the melting temperature (Tm) and the resulting larger difference between specific (1p) and non-specific (1m) signals

反义技术（Antisense Technology）

由于对互补核酸的结合亲和力增强，LNA很有可能被用于反义技术，与此同时LNA的高核酸酶抗性是体内和体外应用的重要优势。大量研究证实了LNA作为反义试剂的优越性，常规技术即可用于转染LNA寡核苷酸。对于knockdown microRNA或其他小RNA等实验目的，可以通过设计LNA反义寡核苷酸以通过碱基配对与其靶序列杂交。另外，还可以通过引入硫代磷酸酯骨架以获得更强的核酸酶抗性。

以Exiqon公司基于LNA专利技术的microRNA检测平台（Exiqon miRCURY LNATM Universal RT microRNA PCR芯片）为例：

1.png

Exiqon的LNATM专利技术解决microRNA PCR检测的两大难题：

2.png

LNA的化学结构。LNA能够提高引物与靶标分子的稳定性，增加引物的熔解温度（Tm值）；也就是说，LNA Oligos在更短的长度情况下，能够保持很高的Tm值。

3.png

4.png

左图碱基进行LNA修饰后△Tm值显著增加，PCR交叉反应的可能性大大降低。右图，人工合成序列相似的microRNA分子，用Exiqon miRCURY LNATM Universal RT microRNA PCR芯片的检测结果。

Exiqon miRCURY LNATM Universal RT microRNA PCR芯片反应原理：

9.png

10.png

Exiqon miRCURY LNATM Universal RT microRNA PCR芯片特点（结合其他公司的图片进行说明）：

1. 灵敏度高。检测单个microRNA仅需1pg总RNA。从1个细胞提取的10pg总RNA就足够用于检测microRNA了。

5.png

6.png

13.png

14.png

15.png

16.png

17.png

2. 特异性强。经LNA修饰的PCR引物，可有效区分microRNA之间的单碱基差异。

7.png

18.png

19.png

3. 准确性高。

11.png

12.png

4. 质控严格。

5. 重复性高

8.png

参考以下公司或网站的资料，一并感谢！

http://www.kangchen.com.cn/support/supportmain.asp?ID=31，https://wenku.baidu.com/view/5ed186addd3383c4bb4cd2b2.html，

http://www.sbsbio.com/cuxiao/LNAjishu.pdf，

https://www.jinchutou.com/p-107011546.html