2.3 基于液滴的scRNA-seq数据的比对和定量
2.3.1 一般注意事项
单细胞RNA测序数据在许多方面与bulk RNA测序不同。大多数scRNA-seq技术生成的read序列包含三个关键信息：
- 识别RNA转录本的cDNA片段；
- 细胞barcode（CB）用于识别表达RNA的细胞；
- 唯一分子标识符 (UMI) 用于处理PCR重复read。
与bulk RNA测序相比，scRNA-seq处理的RNA量要少得多，并且进行更多的PCR循环。因此，UMI变得非常有用，并且在scRNA-seq中被广泛接受。文库测序通常采用双端测序，其中一个read包含CB+UMI，另一个read包含实际转录本序列。
典型的scRNA-seq工作流程包含四个主要步骤：
- 将cDNA片段比对到参考基因组；
- 将read分配给基因；
- 将read分配给细胞（细胞barcode分离）；
- 计算独特RNA分子的数量（UMI去重复）。
该过程的结果是基因/细胞计数矩阵，用于估计每个基因在每个细胞中的RNA分子数量。
2.3.2 Cell Ranger中的read比对
Cell Ranger是处理10x Genomics Chromium scRNA-seq数据的默认工具。它使用STAR比对，对read进行剪接感知比对。此后，它使用转录注释GTF将read分为外显子、内含子和基因间区。如果read至少有50%与外显子重叠，则该read为外显子；如果read是非外显子且与内含子重合，则该read为内含子；否则为基因间区read。Read类型分配之后，进行比对质量调整：对于与单个外显子基因座比对上但也与1个或多个非外显子基因座比对上的read，则优先考虑外显子基因座，并且认为该read已可信地比对到外显子基因座，并给予最高比对质量分数。
Cell Ranger通过检查read与转录组的兼容性，进一步将高可信的外显子和内含子read与注释的转录本比对。根据read是否为正义或反义，以及是否为外显子、内含子或它们的剪接模式是否与该基因的转录兼容来对read进行分类。默认情况下，转录组read（上图中的蓝色）会进行UMI计数。
当数据来自细胞核时，很大比例的read来自未剪接的转录本并与内含子比对上。为了计算这些内含子read，可以使用选项include-introns运行“cellranger count”和“cellranger multi”流程。如果使用此选项，则任何以正义链方向比对到单个基因的read——包括上图中标记为转录组（蓝色）、外显子（浅蓝色）和内含子（红色）的read——都将进行UMI计数。包含内含子选项消除了对将整个基因体定义为外显子的自定义“pre-mRNA”参考的需要。重要的是，如果read仅与单个基因兼容，则认为该read具有唯一比对。只有唯一比对read才会进行UMI计数；多比对read会被 Cell Ranger丢弃。在Web Summary HTML输出中，结转到UMI计数的read集被称为“Reads mapped confidently to transcriptome”。
2.3.3 Cell Ranger参考基因组制备
在深入了解参考基因组处理的细节之前，重要的是要注意如何准备默认的Cell Ranger人类和小鼠参考基因组。所有版本均使用主要基因组组装版本（即没有ALT基因座）进行比对。使用可以在https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/release-notes/build#header找到的脚本来过滤注释GTF文件。保留以下类型：蛋白质编码、长链非编码 RNA、反义以及属于BCR/TCR（即V/D/J）基因的所有类型（请注意，较旧的Cell Ranger参考基因组版本不包括后者）。所有假基因和小的非编码RNA都被去除。
Cell Ranger预先打包了多个版本的参考基因组；2020-A是迄今为止最新版本的参考基因组。Cell Ranger以前使用的所有单独的组装和注释组合都列在下面。预计使用每个参考基因组生成的未过滤的scRNA-seq表达矩阵包含与“Genes after filtering”列中的值相等的行数。此外，Cell Ranger还包含人类+小鼠组合参考基因组，这对于涉及人类和小鼠细胞的实验很有用。
2.3.4 Chromium版本和细胞barcode白名单
细胞barcode序列是附着在bead上的合成序列，用于识别单个细胞。唯一序列库称为白名单，取决于Chromium文库制备试剂盒版本。白名单文件可从Cell Ranger知识库获取。Chromium使用的白名单有三个：737K-april-2014_rc.txt、737K-august-2016.txt和3M-february-2018.txt。第一个列表中的CB长14bp，另外两个CB长16bp。下表提供了常见的10x单细胞测序试剂盒的细胞barcode和UMI长度以及对应的白名单文件：
Cell Ranger使用以下算法来根据白名单纠正假定的barcode序列：
- 统计白名单中每个barcode在数据集中的观测频率；
- 对于数据集中每个不在白名单中的barcode，找到汉明距离为1的白名单序列。对于每个这样的序列：
- 计算观察到的barcode源自白名单条形码且在不同碱基处存在测序错误的后验概率（基于碱基Q分数）；
- 用后验概率最高的白名单barcode（超过0.975）替换观察到的barcode。
更正后的barcode用于所有下游分析和输出文件。在输出的BAM文件中，原始未校正的barcode编码在CR标签中，校正后的barcode序列编码在CB标签中。无法分配正确barcode的read将没有CB标签。如果你想知道为什么3M-february-2018.txt文件实际上包含超过600万个唯一序列，可以在https://kb.10xgenomics.com/hc/en-us/articles/360031133451-Why-is-there-a-discrepancy-in-the-3M-february-2018-txt-barcode-whitelist-找到解释。
2.3.5 UMI计数
通常所说的“UMI计数”包括read计数，然后根据UMI序列进行PCR重复去除。在UMI计数之前，Cell Ranger会尝试纠正UMI序列中的测序错误。已可靠比对到转录组的read被放入共享相同barcode、UMI和基因注释的组中。如果两组read具有相同的barcode和基因，但它们的UMI相差一个碱基（即汉明距离相隔1），那么其中一个UMI可能是由测序中的替换错误引入的。在这种情况下，支持较少的read组的UMI被更正为支持较高的UMI。
Cell Ranger再次根据barcode、UMI（可能已更正）和基因注释对read进行分组。如果两组或多组read具有相同的barcode和UMI，但基因注释不同，则保留支持read最多的基因注释进行UMI计数，其他read组则丢弃。如果最大read支持度相同，则所有read组都会被丢弃，因为无法可信地分配基因。
经过这两个过滤步骤后，每个观察到的barcode、UMI、基因组合都会被记录为未过滤的即基因细胞矩阵中的UMI计数。支持每个计数的UMI的read数也记录在分子信息文件中。
2.3.6 细胞过滤
未过滤的基因细胞矩阵包含许多实际上是空液滴的列。由于技术噪声，这些液滴中的基因表达计数不为零。然而，它们通常可以通过存在的RNA数量与真正的细胞区分开来。Cell Ranger中有两种算法实现这种细胞过滤，我们将其称为“Cell Ranger 2.2”和“Cell Ranger 3.0”过滤。
Cell Ranger 2.2在“barcode计数与每个barcode的 UMI”图中识别出了第一个“拐点”。Cell Ranger 3.0引入了一种改进的细胞识别算法，该算法能够更好地识别低RNA含量细胞群，尤其是当低RNA含量细胞混入高RNA含量细胞群中时。例如，肿瘤样本通常含有较大的肿瘤细胞与较小的肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）混合，研究人员可能对TIL群体特别感兴趣。新算法基于EmptyDrops方法（Lun et al.，2018）。
2.3.7 基于伪比对的方法
伪比对也可用于快速量化scRNA-seq数据集。目前，有两个软件套件实现了这种方法：kallisto/BUStools和Salmon/Alevin/Alevin-fry。为了保留模块化方法，两个生态系统都引入了自己的格式用于存储定量结果：kallisto/BUStools引入了BUS（barcode、UMI和Set）文件格式（Melsted等，2019），而Alevin/Alevin-fry使用RAD格式来实现相同目的（Srivastava等，2019）。
kallisto/BUStools和Alevin/Alevin-fry都实现了各自的细胞barcode和UMI纠错和分离算法——例如，Alevin不需要（但可以使用）细胞barcode白名单。然而，与基于比对的方法最大的区别在于伪比对的准确性较低，并且包含多比对read。
kallisto/BUStools支持许多测序技术，包括CEL-seq、CEL-seq2和SMART-seq等低通量技术。可以使用kb --list打印受支持的实验的完整列表。Alevin目前仅支持两种最流行的基于液滴的单细胞方法，即Drop-seq和10x Chromium。
总体而言，kallisto/BUStools和Alevin效率极高，允许使用2-4 Gb RAM处理人类或小鼠数据集，并且速度至少比Cell Ranger快一个数量级。这两种工具还能正确处理多比对read，从而减少受影响基因的定量偏差。然而，一些出版物指出，基于伪比对的方法会错误地将保留内含子的read比对到转录组（Melsted等，2021；Srivastava等，2020）。众所周知，scRNA-seq实验，尤其是单核RNA-seq可以包含非常高比例的保留内含子的转录本。这种错误的分配使得数百个未表达的基因看起来微弱表达，这可能会严重影响下游分析，特别是marker选择（Kaminow等，2021）。因此，我们仍在努力开发至少与Cell Ranger一样准确且速度更快的方法。
2.4 STARsolo和Alevin-full-decoy：高速、高精度
STARsolo是一个独立的流程，是本章前面提到的STAR RNA-seq比对软件的一部分。它的开发目标是生成与Cell Ranger非常相似的结果，同时保持计算效率。通常，STARsolo在相同数据集上比Cell Ranger快几倍。STARsolo的UMI去重、细胞barcode分离和细胞过滤方法有意重新使用Cell Ranger的算法。从STAR 2.7.9a版本开始，STARsolo还能够正确定量多比对read，使其成为快速准确的scRNA-seq处理的非常有吸引力的选择（Kaminow等，2021）。STARsolo的另一个好处是它可以灵活地实现细胞barcode和UMI搜索：了解其在read内的相对位置和每个序列的长度，就可以处理大多数scRNA-seq方法生成的数据。
Alevin的开发人员也认识到了上述内含子read的问题，并开发了一种特殊的解决方案，即使用所谓的诱饵序列。在最近的STARsolo预印本中，带有全基因组诱饵的Alevin表现出与STARsolo或Cell Ranger非常相似的准确性（Kaminow等，2021）。
2.5 非模式生物
使用单细胞RNA测序来表征鲜为人知的多细胞生物正变得越来越流行，尤其是作为重要物种de novo基因组组装项目的一部分。这里有两点需要注意。首先，正确组装和注释良好的线粒体序列至关重要，因为线粒体read构成了每个scRNA-seq文库的很大一部分，并且广泛用于实验质量控制。最近的努力整理了许多非模型脊椎动物的线粒体序列（Formenti等，2021）。MITOS2是一个专门的服务器，可用于自动生成高质量的后生动物线粒体注释。
其次，值得注意的是，大多数de novo测序基因组的注释方法生成的基因模型不包含UTR序列。3’和5’ scRNA-seq方法的read分布都严重偏向基因的两端。因此，使用没有UTR序列的基因注释将会极大地扭曲量化和分析的结果。
2.6 小结及建议
Cell Ranger是10x Genomics提供的默认软件，它仍然是read比对和定量最广泛使用的工具。如果您缺乏生物信息学经验，或者使用Cell Ranger处理了许多其他样本，请坚持使用它。推荐使用最新的Cell Ranger版本及其附带的最新注释文件。同时，STARsolo和Alevin-full_decoy提供了巨大的计算加速和多比对的正确处理，从而减少了定量偏差，同时保持了与Cell Ranger的高度兼容性。对于有终端工具使用经验的用户来说，它们可能是最好的选择。最后，如果您正在处理注释不充分的基因组，请确保您的基因模型包含UTR，并且拥有组装良好且注释良好的线粒体。
往期内容：
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