二代测序中应用的生物技术：
- 酶切技术
- PCR扩增技术
- 凝胶电泳技术
- 毛细管电泳分离技术
- 边合成边测序技术（SBS）
1.酶切技术
2.凝胶电泳技术
凝胶电泳（Gel electrophoresis）或称胶体电泳，是一种用于大分子（如DNA、RNA、蛋白质）以及其碎片的分离、分析技术。——凝胶电泳
DNA带负电荷（因为磷酸残基），故DNA片段往正极方向移动，DNA片段较短的移动的较远。DNA带是肉眼看不见的，需经染料染色。
凝胶电泳动画
3.PCR扩增技术
聚合酶链式反应（英语：Polymerase chain reaction，缩写：PCR）又称多聚酶链式反应，是一项利用DNA双链复制的原理，在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。——聚合酶链式反应
- 加热。使DNA双链解开，形成单链。
- 在单链上加上引物。
- 加入DNA聚合酶。
有了以上技术，接下来可以开始测序
4.双脱氧核苷酸
3'端的OH脱氧变成H，双脱氧核苷酸就没办法反应形成磷脂键，相当于一个终止基团。
如下图右边所示，在PCR反应中，如果加入双脱氧核苷酸，当遇到双脱氧核苷酸时就停止到这个位置，得到一个合成不完全的片段。不同的片段具有不同的长度，再结合高分辨率的凝胶电泳技术，就可以得到该片段的序列。是早期人类基因组采用的技术，缺点是非常耗时，人工量非常大。
改进部分：用荧光基因标记双脱氧核苷酸，再用毛细管电泳分离技术检测。
这是桑格测序的方法，采用了自动化的方式，但通量比较慢。
5.边合成边测序技术（SBS）
二代测序的化学反应的基础。
如下所示，步骤：
- 结合G
- 去除其他的基团
- 测出G
- 消去保护基团、荧光基团
- 结合A
- ……
思考题
1.荧光检测的灵敏度需要一定的荧光基团的量，需要多少才能满足要求呢?如果不同的荧光基团混杂在一起，显然会对检测造成干扰?因此测序需要每次只检测一种类型的碱基，如何解决这个问题?
2.酶切、PCR等生化反应也必然遵从反应热力学和动力学等物理化学规律。从反应热力学和动力学角度考虑边合成边测序过程需要考虑哪些因素?
参考视频：二代基因测序之生物技术（very nice！！！）
