发表杂志：Oncogene
影响因子：8.756
本文属于单肿瘤分型思路，类似的分型文章我们也解读过很多。
肿瘤分型文章比较重要的结论就是分型后构建的评分能够预测免疫治疗或者其他治疗的疗效。可以用于分型的基因集很多，结合热点做分析会事半功倍，现在上车正是时候！
本文之所以发top期刊，主要原因之一是作者有自己的大样本队列。如果我们做这类肿瘤分型分析，最好还是要筛选热点基因集，蹭热点分型才更好发表。
生信分析咨询
请关注生信小课堂，全网同名
研究概述：
本文对291个配对的肿瘤和非肿瘤组织样本（216名PTC患者和75名BTN患者）进行全面RNA测序，以揭示其转录组学和基因组特征。利用共识非负矩阵分解（NMF）推导并完善了PTC中的4种新型分子亚型，进一步验证它们在TCGA数据库中的可重复性。4种亚型中的每一种都与不同的遗传和转录组学特征，免疫模式和临床病理学特征有关。此外，作者筛选出可以区分良性和恶性甲状腺结节的标记基因。这些发现有望帮助优化甲状腺癌的诊断和治疗。
研究结果：
一、甲状腺结节的转录和基因组改变的概况
1、为找到良恶性甲状腺结节的分子特征，对225例PTC和77例BTN患者进行全面的体积RNA-seq分析(图1a)。
2、纳入216对PTC及邻近组织和75对BTN及邻近组织分析。主成分分析中，BTN和PTC之间存在明显的分离(图1b)。在BTN和PTC之间，共有3944个基因的表达水平发生变化(图1c)。
3、差异表达前20位的基因(DEGs)主要与恶性肿瘤的进展有关，包括SYT12、CLDN10、COL9A3、SFRP1、MT1G、MTIH等(图1d)。
二、基于转录组的甲状腺结节分子分类
1、对291个良恶性甲状腺结节样本进行无监督NMF聚类，确定6种亚型，4种以PTC为主，2种以BTN为主（图2a）。对PTC的4种亚型（亚型2，3，4和6）的特征进一步分析，亚型2免疫评分最高，称为免疫富集亚型(immune - enrichment Subtype)；基质评分最高的亚型3称为基质亚型。BRAF V600E突变主要富集于亚型4（BRAF富集亚型）。亚型6（CNV富集亚型）中CNV的比例显著高于其他亚型（图2a）。
2、作者对这4种亚型进行临床病理学数据分析， BRAF富集亚型中的PTC比其他亚型更容易发生甲状腺外扩张。大多数III/IV期PTC也聚集在BRAF富集亚型（图2b）。在肿瘤多灶性、淋巴结转移和远处转移方面，这4种亚型之间差异无统计学意义。
3、构建由各亚型的一组标记基因组成的分子分类器，通过随机森林方法验证其对各亚型的特异性。使用该分子分类器将TCGA队列中的497例PTC病例分为4个亚型（图2c）。
4、采用ARACNe和GSEA方法构建基因-通路共表达网络鉴定每个PTC亚型中分子特征的潜在枢纽基因。在以BTN为主的亚型（亚型1和5）中，氨基酸代谢和脂质代谢途径上调，而MAPK途径，JAK-STAT途径和各种免疫细胞功能下调，包括T细胞，B细胞和NK细胞（补充图2a，b）。
5、在PTC的4个亚型中，基质亚型的枢纽基因主要编码细胞外基质蛋白，参与调控多种经典致癌途径，包括MAPK信号传导、Wnt信号传导、TGF-β信号通路（补充图3a，c）。
6、在CNV富集亚型中，包括TMSB10在内的大多数枢纽基因是癌基因，而几种致癌途径和免疫途径下调（补充图3b，d）。
三、免疫富集亚型的特征
1、免疫富集亚型的大多数关键调控基因与免疫细胞的功能有关，包括CORO1A、CD3E、LCP1、ACAP1、HLA-DRA、CCL19和RAC2（图3a）。
2、基因集富集分析显示抗原处理和呈递富集，T细胞分化（Th17，Th1和Th2分化），自身免疫性甲状腺疾病，NF-κB信号传导，趋化因子和细胞因子信号传导。两种经典致癌途径JAK-STAT和MAPK通路也在富含免疫的亚型中被激活（图3b）。
3、免疫富集亚型、基质富集亚型和braf富集亚型的患者显示免疫抑制成分富集，如Treg、M2巨噬细胞、M-MDSCs和TGF-β信号。但免疫富集亚型也与积极的免疫反应相关，包括抗肿瘤免疫细胞(如CD8 T细胞，M1巨噬细胞，NK细胞)的富集和适应性免疫反应基因(如CD8A, TNF, GZMB, PRF1, IFNG)的过表达（图3c）。
4、免疫富集亚型中PD-1、PD-L1、CTLA4和T细胞发炎GEP评分的表达均高于其他亚型（图3d）。
5、mIHC进一步证实亚型之间的免疫浸润状态，富含免疫力的亚型对CD8+T细胞、FoxP3+Treg细胞、CD86+M1巨噬细胞和CD163+M2巨噬细胞的浸润显著高于富集BRAF亚型和BTN亚型（图3e）。
四、BRAF富集亚型的特征
1、大多数BRAF突变（75%）和RET基因融合集中在亚型4（BRAF富集亚型）中。BRAF富集亚型的多个枢纽基因与BRAFV600E突变密切相关，包括MUC1，LRRK2，SLC34A2，FOXQ1和KRT19（图4a）。
2、基因集富集分析确定了经典的BRAF突变相关信号传导，即MAPK信号传导（图4b）。与肿瘤转移相关的通路也富集在此亚型中，包括Notch信号传导和局灶粘附。
3、采用IHC和细胞功能实验，LRRK2和SLC34A2在富含BRAF的亚型中均高表达（图4c，d）。
4、用靶向LRRK2的siRNA转染BCPAP和KHM-5M两种甲状腺癌细胞系，并通过qPCR和蛋白质印迹证实其敲低效率（补充图4a，b）。敲低LRRK2在体外和体内显著抑制了甲状腺癌细胞的生长（补充图4c-f）。
5、对富含BRAF的亚型进行亚分类分析，确定了三个亚类。亚类1(富braf -1)甲状腺外侵犯的比例最高（图4e）。与braf -富2亚型和braf -富3亚型相比，braf -富1亚型中有几个致癌基因明显上调，包括CST6、NGEF、ETV4和BNIPL(图4f)。
五、甲状腺良恶性结节的基因表达图谱
1、利用甲状腺结节的基因表达谱数据构建甲状腺结节轨迹， Monocle的伪时间轨迹轴显示BTNs与BTN相邻的甲状腺组织闭合，且大多位于轨迹的起点(图5a)。
它们转分化为PTC，在轨迹的后半部分分叉为两个不同的分支，分析四种PTC亚型在轨迹上的分布（图5a和补充图5a）。绘制轨迹中的TDS发现沿此轨迹甲状腺结节分化程度降低(补充图5b)。
2、免疫评分沿轨迹增加，在下分支末端达到最高，主要分布在免疫富集亚型(补充图5c)。braf富集亚型主要分布在TDS最低的上部分支(补充图5d)。
3、分析2582个差异表达基因的表达变化，观察表征模式的三个基因簇（图5b）。簇I（前分支）中的基因主要参与甲状腺的生物过程（例如TFF3和TPO），并沿轨迹逐渐下调；簇II基因在上分支末端被激活，其中大多数被报道促进PTC进展（例如ARHGAP和CITED1）；簇III基因主要与免疫反应（如CCL19和CXCL13）有关，上调并保持在高表达水平，直到下分支的最后阶段（图5c）。
4、通路富集分析证实4种PTC亚型在轨迹上的分布，下支基因主要富集在免疫通路中，上支基因表现出经典致癌途径的富集（补充图5e）。
六、PTC与BTN分化的基因特征
1、将所有样本按8:2的比例随机分为训练队列和验证队列，确保两队列阴性和阳性比例一致。使用递归特征消除和逻辑回归分析得到20个基因的表达特征(图6a)
2、ROC检验的AUC为0.9839(图6b左)。为验证基因表达特征的实用性，在独立验证队列中测试了20个基因组合，AUC为0.9004(图6b右)，这是一组区分PTC和BTN的优秀生物标志物。
研究总结：
为弥补甲状腺癌缺乏成熟实用的分子分类体系的差距，利用大型中国PTC和BTN队列的综合转录组和基因组图谱以及关键的临床特征，通过综合分析发现了4个生物学特征和驱动基因相同的分子亚型(免疫富集，基质富集，BRAF富集和CNV富集)，并在TCGA队列中得到证实。甲状腺癌的病理特征包括甲状腺外延伸和TNM分期与该分子分型系统有关。
此外，从BTN生成了20个基因表达的标记用于诊断PTC，通过成本较低的qPCR，该标记可能在未来的临床实践中得到应用。这些数据提供了对PTC分子画像的全面阐述，并为更准确的疾病评估和治疗铺平了道路。
