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研究概述：铜中毒是一种铜依赖的细胞死亡机制，与肿瘤进展、预后和免疫反应有关。然而，Cuproptosis相关基因(CRGs)在三阴性乳腺癌(TNBC)肿瘤微环境(TME)中的潜在作用尚不清楚。本研究从在线数据库中收集了346例TNBC样本并进行分类。研究不同亚组与TME的临床病理特征、免疫浸润特征和突变状态之间的关系。最后，通过构建列线图和校准曲线来预测患者的生存概率，以提高CRG_score的临床适用性。本研究揭示了CRGs对TNBC的TME、临床病理特征及预后的潜在影响。

研究结果：

一、乳腺癌中CRG的遗传变异及铜死亡相关CRG的富集

1、从文献中鉴定了16个与铜死亡相关的基因，总结了这些CRG在乳腺癌中的CNV发生位置、发生率和体细胞突变的发生率。（图1A、B、E）

2、构建了CRGs的相互作用网络，主成分分析（PCA）显示四个队列的数据离散度降低。说明CRG表达失调在乳腺癌发生中起着关键作用。（图1C、D）

3、相关性分析表明，5个基因的差异表达与预后显著相关。GO分析显示，这些基因主要参与生物过程和分子功能。KEGG结果表明，这5个DEGs在三羧酸循环中显著富集。疾病富集分析显示，营养缺乏、毛发疾病和金属代谢紊乱等疾病与CRGs相关（图2A-C）

二、基于CRGs的肿瘤分类及相关免疫浸润、CRG的生成和功能注释

1、TCGA TNBC队列根据两种不同的CRGs分为聚类A和聚类B。PCA显示两组间CRGs的转录谱存在显著差异（图3A-C）

2、B组富含先天免疫细胞浸润，包括活化的B细胞、活化的树突状细胞等。A组显示LIAS、LIPT1、DLST和ATP7A的表达水平升高。两组间肿瘤分期存在差异。簇A在基质和致癌激活通路中显著富集，如TGF信号通路、粘附相关信号通路等。A显示出生存曲线的劣势（图3D-G）

3、CRG的生成和功能注释：TNBC患者被分为两个基因亚组，分别为C1和C2，肿瘤分期的T4、M1、N2-3和VI期主要集中在C1组，并被证实与较差的OS相关；ATP7A主要在C1组中表达，而LIPT1和PDHA1在C2组中显著富集。（图4A-E）

三、建立预测模型、检测有效性

1、首先利用LASSO分析及lambda回归建立了基因模型，并构建了CRG评分系统。高分组与CRG聚类B匹配，低分组与CRG聚类A匹配；在CRG_score和基因簇的亚组比较中，我们发现C1的CRG_score高于C2。CRG_score和基因聚类之间存在显著的统计学差异（图5A-E）

2、评分低的患者都存活，而一些评分高的患者已经死亡。在两个CRG基因簇中均观察到与抑制调控相关的基因显著表达（图5F-G）

3、在训练集A、验证集B、LOOCV验证集三组队列中，比较了低、高亚组患者的生存概率、风险评分分布、生存状态和相关基因表达。总的来说，高亚组的预后较差。（图6A-I）

4、ROC曲线结果表明，该预测模型对短期随访和长期随访均有良好的预测价值。并且，CRG对TNBC有独特的影响。（图6J-N）

5、临床相关分析中，高CRG_scores在年轻女性中观察到较多，两组间肿瘤位置无显著性差异。单因素和多因素Cox回归分析证实，肿瘤分期和CRG_score是TNBC患者OS的独立预后因素。CRG_score也具有与年龄无关的预后价值（图7A-G）

四、亚组间免疫活性的比较

1、更多的内皮细胞和CAFs与高危组相关；CD4记忆静息T细胞、嗜酸性粒细胞等与LIPT1呈显著负相关。调节性T细胞和NK细胞与ATP7A呈显著的负相关。对不同亚组进行的TME评分显示，高分组的肿瘤间质评分较高。CRG_scores较高，患者预后较差。低评分组的MSI较高，预后较好。（图8A-D）

2、图8E显示了高危组和低危组之间的免疫评分、基质评分和免疫细胞表达水平的差异。两组间三个常见的免疫检查点基因PDCD1、CD274和CTLA4没有差异。CRG_score组患者仅通过抗CTLA-4治疗才显示出显著的治疗效果。（图8E-J）

五、CRG_score的遗传特征和TNBC的肿瘤体细胞突变

1、低评分组的TMB更为广泛。低评分组中最明显的体细胞突变为TP53和TTN，而高评分组中最明显的体细胞突变为TP53和PTEN。（图9A-B）

2、生存分析显示，低CRG_score和H-TMB的亚组具有较好的生存获益，而高CRG_score和L-TMB的亚组的生存概率较低。（图9C-D）

3、GO及KEGG分析表明，ATP7A和CRG_score在C1组中含量较高，这与大多数癌症中信号通路的富集相一致。（图9E-F）

六、基于CRG_score的列线图的构建与评价、药物敏感性评价

1、使用三个参数，年龄、肿瘤分期和CRG_score，来预测OS，结果显示，列线图与理想模型一致。ROC结果显示，新的列线图预测模型具有较高的精度。（图10A-E）

2、厄洛替尼、依托泊苷等在高CRG_scores患者中的半抑制浓度值较低。低CRG_scores的患者中，伊马替尼、比卡鲁胺、贝洛替尼等化疗药物的半抑制浓度值显著降低。表明，CRGs与药物敏感性相关（图11A-H）

七、抑制ATP7A可以抑制乳腺癌细胞的增殖和迁移能力

1、敲低ATP7A后，显著抑制了乳腺癌细胞的增殖能力。

2、Transwell迁移实验显示ATP7基因敲低的乳腺癌细胞的迁移细胞数量显著减少。综上所述，ATP7A表达显著抑制了乳腺癌细胞的增殖和迁移能力，这与其在乳腺癌患者中的致瘤作用相一致。（图12）

研究总结：
本研究发现了两个具有免疫细胞浸润特征的CRG簇，与免疫炎症簇和免疫缺乏簇高度一致。此外，研究证明该基因特征可以用来评估肿瘤免疫细胞浸润、临床特征和预后状态。低CRG_score的特点是肿瘤突变负荷和免疫激活较高，生存概率高，对CTLA4的免疫反应性强，而高CRG_score的特点是间质通路激活和免疫抑制。CRG与TNBC的肿瘤免疫密切相关，是预测患者预后的潜在工具。我们的数据为未来新药的开发提供了新的方向。