使用NCBI进行目的基因的引物设计
全文概述
利用生信工具进行目的基因的引物设计，使用了NCBI进行筛选与设计引物，使用 idtdna对筛选出的DNA进行检查。本文分享了如何筛选出高质量的基因引物，帮助想通过生信进行引物设计的学生、从业者找出合适的基因，毕竟购买引物也比较烧钱，避免设计出的基因质量偏低。
NCBI查找基因
1.查询目的基因：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/?term=zbed3
备注：这里需要注意的是，要找到合适的目的基因！如果找智人，一般会是NM开头
2.选择其中一个数据连接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_001329564.2，选择Pick Primers
3.进入：
设计-筛选设置
4.根据一些实验经验调节一些关键参数：
1）Primer Parameters-PCR product size：设置为75-300
2）Exon/intron selection- Exon junction span：设置必须跨越外显子（Primer must span an exon-exon junction），避免污染
3） Advanced parameters - Primer Parameters：GC建议在40%-60%之间
5.点击Get Primers
6.跳转页面
7.挑选合适的primer pair，其中product length最好是在150附近（不是绝对）
设计-DNA检查
8.注册idtdna进行dna分析，https://sg.idtdna.com/calc/analyzer
9.抽取其中一个primer pair
Primer pair 6
| Sequence (5'->3') | Template strand | Length | Start | Stop | Tm | GC% | Self complementarity | Self 3' complementarity | |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Forward primer | ACAGCAACACAGAAGACCGT | Plus | 20 | 604 | 623 | 59.82 | 50.00 | 3.00 | 3.00 |
| Reverse primer | CCAGTAAGCTTGCCATTGAGC | Minus | 21 | 749 | 729 | 59.87 | 52.38 | 6.00 | 3.00 |
| Product length | 146 | ||||||||
| Exon junction | 737/738 (reverse primer) on template NM_001115114.1 |
Products on intended target
NM_001115114.1 Danio rerio glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (gapdh), mRNA
product length = 146
Forward primer 1 ACAGCAACACAGAAGACCGT 20
Template 604 .................... 623
Reverse primer 1 CCAGTAAGCTTGCCATTGAGC 21
Template 749 ..................... 729
10.使用idtdna进行筛选
举例：正旋：ACAGCAACACAGAAGACCGT，反旋：CCAGTAAGCTTGCCATTGAGC
以此使用正旋与反旋填写入sequence，如图使用正旋，点击self-dimer，如果序列结果中，basePairs都小于10，那么这个引物就算比较好的了，不是自旋产生的。
11.接着正反计算，输入正反旋，年级HETERO-DIMER,最后点击CALCULATE，如果序列结果中，basePairs都小于10，那么这个引物就算比较好的了，不是自旋产生的。
