Inflammasome Activation Triggers Caspase-1-Mediated Cleavage of cGAS to Regulate Responses to DNA Virus Infection

文献摘要：

病毒感染会诱发宿主的天然免疫应答，产生各种细胞因子，例如IFN-I，激活炎性小体，触发感染细胞的程序性死亡。严格调控炎性细胞因子的产生对于控制感染的同时又不损伤宿主，有着重要的意义。作者研究了利用DNA病毒感染ASC-/-与Casp-/巨噬细胞，发现这两个分子的缺陷会导致IFN的产生增加，但RNA病毒的感染却未有此表型。针对这种表型的机制研究结果表明，一旦经典（canonical）炎性小体或非经典（non-canonical）炎性小体活化，那么caspase-1就会与细胞质中的GMP-AMP（cGAMP）合成酶（cGAS）相互作用，将cGAS酶解(cleave)，抑制cGAS-STING介导的IFN的产生。炎性小体信号转导的缺陷，会增强宿主对DNA病毒的抗性（体内，体外），这种调控作用还会扩展到其它炎性caspases方面。因此，炎性小体的活化会抑制cGAS依赖的信号转导，这说明了胞内DNA识别通路之间存在着交叉调控作用。

背景知识

TLR3识别双链RNA，触发由TRIF介导的的下游信号，RIG-I识别细胞质中的病毒RNA，通过MAVS进行信号转导。cGAS识别细胞质中的DNA，产生cGAMP，激活STING发挥作用。RNA polymerase III是细胞质中的另外一个DNA感受器，能将富集AT的dsRNA转换为dsRNA，刺激RIG-I-MAVS通路。以上受体的活化会诱导NK-kappaB的活化，以及IFN调节因子IRF-3或IRF-7的活化，产生各种细胞因子，例如IFN-I。分泌的IFN-I能与其受体结合，诱导ISGs的表达，ISGs会干预病毒复制的每一步，使细胞处于抗病毒状态。

微生物的感染会导致病理性炎性，是由炎性小体复合物介导的，导致炎性caspase的活化（例如人体中的caspase-1，caspase-4/5,小鼠中的caspase-11）。炎性小体由NLRs触发，NLRs识别病毒的核酸，以及死亡细胞的内源分子。一旦活化，NLRs能寡聚体化，在ASC的辅助（或者不辅助下）招募pro-caspase-1，导致caspase-1的活化，接着产生IL-1beta和IL-18。细胞质中的dsDNA出现后，AIM2能激活ASC依赖的炎性小体活化。caspase-1或caspase-11诱导的一种细胞裂解形式称为细胞焦亡(pyroptosis)。caspase-1参与天然免疫活化过程中蛋白质的酶解，例如MaI和TRIF，导致细菌感染过程中，细胞因子生成的降低。

IFN-I能抑制病毒的复制，但是IFN-I生成的异常也会导致病变，微生物的感染通常会导致IFN-I的产生与炎性小体的活体，这两者的平衡有着重要意义。有文献报告，风湿病就是由炎性小体诱导的促炎性细胞因子的分泌或者是异常的IFN-I的产生。还有文献报告，IFN-I能抑制炎性小体的活化。各种炎性小体，NLRX1，NLRP4，NLRP6，NLRC3，NLRC5也能负向调节IFN-I的产生。

作者在这篇文献中指出，在炎性小体的活化过程中，caspases能通过cGAS的酶切来控制抗病毒活动。炎性小体一旦活化，caspase-1就会直接与人类cGAS结合（在D140/157结合位点），并酶切cGAS，进而导致cGAMP水平的下降，以及细胞因子的下降。总之，使用DNA而非RNA病毒感染caspase-1,AIM2-，ASC缺陷的小鼠，这些小鼠会表现出抗性。在非经典的炎性小体活化过程中，caspase-4,caspse-5,caspase-11也能酶切cGAS。作者还发现，位于人类cGAS的122到133残基的N端R/K区域，以及小鼠cGAS的119到132区域对于此酶正常功能的发挥有着重要意义。作者的研究发现了，caspase在调控cGAS-STING通路方面的作用，为炎性小体与抗病毒天然免疫方面的协作提供了研究思路。

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**结果****1-Asc或casp1缺陷的巨噬细胞的细胞因子产生增多，能抵抗DNA病毒的感染

Fig1AB-WT，Asc-/或casp1-/-巨噬细胞被HSV-1，gDNA，VACA，SeV感染后，IFN-I随时间的变化图。结果说明，DNA病毒感染后，IFN-I在两个敲除的巨噬细胞中IFN-I与IL-6的分泌量增加，但RNA病毒的感染没有此表型。

HSV-1是单纯疱疹病毒，Vaccinia virus（VACV）是牛痘病毒，这两个病毒在免疫学实验中，常常用于构建DNA病毒的感染模型。 此外，还常用gDNA作为DNA感染模型，gDNA通常是使用Calf thymus genomic DNA。Sendai virus是仙台病毒，常用于构建RNA病毒感染细胞的模型。VSV全称是Vesicular Stomatitis Virus，即水疱性口炎病毒，常用于RNA病毒感染模型。因此Fig1AB中使用了DNA与RNA病毒分别来做感染模型，用于说明DNA病毒感染的某种特异性。IL-6是一种炎症因子，它的上升表明细胞炎症功能增强，IFN-I能抑制病毒的感染，水平上升也表达细胞的炎症活性增强。

Fig1C-感染DNA或RNA后，这两个敲除株细胞的TBK1的活化情况。可以发现，p-TBK1，Viperin（一种抗病毒的蛋白，ISG产物）在gRNA，HSV-1，VACV中都增强，在SeV中没有什么变化。共聚焦也显示，Asc-/-,Casp-/-也对HSV-1-GFP（DNA病毒）的感染有抑制作用。

Fig1ABC共同说明了，ASC和caspase-1对病细胞质中的DNA识别有抑制作用，但对细胞质中的RNA则无相应作用。以上是在小鼠模型中做的。为了研究这两个分子在人源细胞中的作用，再往下，作者研究了相应人源细胞中的这两个分子的作用。

Fig1D-人源细胞模型。用shRNA敲低THP-1（人类急性单核淋巴细胞系）caspase-1来作为研究模型。用VACV（DNA病毒）或HSV-1（DNA病毒）来感染此敲低株的细胞，IRF3的活性上升，Viperin表达上升。

IRF3是干扰素调节因子3(Interferon regulatory Factor 3)，是干扰素调节因子家族成员之一 ，与病毒感染时干扰素基因的表达密切相关，IRF-3组成性表达在多种细胞中，主要存在于细胞浆中，病毒感染等因素可诱导IRF-3 12C端磷酸化，使IRF-3形成二聚体并移位至细胞核，并与其他转录因子如CBP/p300结合诱导IFNα/β和IFN刺激基因的表达，在抗感染免疫中发挥重要作用。

Fig1E-敲除了caspase-1后，THP-1细胞感染了DNA病毒后，IFN-I上升，RNA病毒的感染未有此变化，与小鼠的数据一致。

Fig1F-有文献报告，细胞质中存在dsDNA时，AIM2能激活ASC依赖的炎性小体。从AIM2敲除的小鼠取的巨噬细胞表明，DNA病毒能诱导IFN-I的产生，但RNA病毒无此作用。这里使用了AIM2敲除的巨噬细胞是因为，AIM2是ASC的上游蛋白，ASC对DNA病毒的感染是有抑制作用的，由于AIM2缺失，在这种细胞中，它不会激活ASC，因此细胞会表达出更强的炎症。AIM2作为细胞质DNA受体，能够与ASC和caspase-1形成炎性复合体，参与宿主对多种DNA病毒和胞内菌的天然免疫反应。ASC，caspase-1，AIM2形成的 炎性复合体结构如下所示：

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其中pyrin domains是AIM2的结构域。

Fig1G-Aim2-/-巨噬细胞在感染了DNA病毒后，TBK1的活化增强。Viperin合成增多。TBK1的作用：TBK1磷酸化（红点）转录因子IRF3（因此在实验的后面部分，会检测IRF3的磷酸化水平），IRF3然后会进入 细胞核，诱导I型干扰素的表达。巨噬细胞敲除了AIM2后，TBK1增强，干扰素增多，这就说明了AIM2对干扰素的生成是负调控的，而AIM2的下游是ASC与caspase-1，因此可以说炎性小体的活化能激活ASC与caspase-1，以上的数据共同表明，ASC与caspase-1能负向调控DNA病毒诱导的IFN-I的产生。

Fig1ABCDEFG是细胞实验，接着作者做了活体实验。

Fig1H-I-Casp1-/-，Asc-/-小鼠能抑制VACV病毒的感染，无法抵抗VSV病毒的感染，但VSV的病毒数量有所下降（Fig1I）。---VACV病毒是DNA病毒，VSV病毒是RNA病毒。

Fig1J-在经VACV感染后，Casp1-/-，Asc-/-小鼠肺，脾脏中的IFN-I，IL-6合成升高。

AIM2,ASC或caspase-1的缺失会导致机会对DNA病毒的应答增强，作者在接下来的部分中，研究了炎性小体的活化与IFN-I诱导之间的关系。

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Fig2A-先验证了炎性小体的完整性，即用LPS加上APT或鱼藤酮（rotenone）处理后，THP-1中能检测到加工后的IL-1beta。SN指的是上清(supernatants)。LPS加ATP刺激巨噬细胞caspase-1的活化，rotenone能抑制线粒体的电子转化，导致NLRP3炎性小体的活化。LPS与ATP共同作用能够显著提高NLRP3、Caspase-1、IL-1β的表达，这是因为LPS对NLRP3炎性小体的激活是LPS与ATP共同作用实现的，有IL-1beta的正常加工，这说明细胞的炎性小体在功能上是完整的。

Fig2BC-当首次使用Rotenone（不加LPS，Fig2B）或LPS+ATP（Fig2C）或MALP2+APT诱导炎性小体活化时时，IRF3磷酸化与Viperin的表达几乎完全丧失。

Fig2D-当炎性小体活化后，VACV诱导的I型干扰素的产生丧失。

Fig2BD-THP-1细胞感染HSV-1后，诱导的I型干扰素的产生丧失，而RNA病毒SeV则无此现象。

Fig2BCD的结果说明，炎性小体的过度活化会降低人源细胞DNA病毒诱导的IFN-I的产生。

作者是先做了人的细胞（Fig2ABCD），随后作者又在鼠源细胞中进行了验证。

使用的鼠源模型是永生化的骨髓来源巨噬细胞（iBMM，immortalized bone-marrow-derived macrophages）。

Fig2F-先验证了iBMM中炎性小体的完整性。

Fig2E-验证了iBMM中炎性小体中IFN-I应答的完整性。

Fig2G-炎性小体的活体能抑制VACV诱导的IFN-I的活化，检测指标是TBK1的磷酸化，Viperin，IFN-I。

Fig2H-作者使用了Gsdmd缺陷的巨噬来研究了炎性小体活化后，IFN-I的活化情况。做这个实验的目的在于，炎性小体的活化会导致细胞焦亡，从而可能会减少IFN-I的分泌。但是，炎性小体的活化不影响RNA病毒诱导的IFN-I的产生，作者推测，caspase-1介导的细胞焦亡可能在这一过程中不起主要作用，为了验证这个假设，使用了GSDMD缺陷的iBMM细胞，因为GSDMD缺陷的细胞，能抑制caspase-1/11介导的细胞焦亡。

使用LPS+ATP处理iBMM缺陷的巨噬细胞，然后使用VACV或SeV来感染。数据可以发现，Viperin或p54的诱导会降低。

Fig2中的数据表明，炎性小体的活化会抑制DNA病毒诱导的IFN-I的产生。前面都是在细胞水平上，通过基因编辑的手段来做的，作者又补充了抑制剂抑制caspase蛋白来研究相关的表型。

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Fig3A-VX765是caspase-1的抑制性抑制剂，它能抑制IL-1beta的产生。

Fig3B-VX765能抑制caspase-1的活化。指标是p20亚基含量降低，因为caspase-1能切割IL-1的前体，参与死亡受体介导的凋亡。caspase-1是以无活性的酶原形式(pro-caspase-1）存在于细胞质中，分子量是45kDa，pro-caspase-1会自体水解，产生p20和p10两人个大小亚基。

Fig3C-使用VX765抑制caspase-1后，可以发现，DNA诱导的IRF3的磷酸化，Viprin的表达都增强，RNA病毒无此现象。

Fig3D-小鼠的巨噬细胞中也有3C的现象。

Fig3E-Casp1敲除的细胞中无法出现炎性小体的活化，提前用ATP加LPS处理这种细胞，细胞会出现VACV诱导的IFN-I与Viperin生成的减少。

Fig3ABCD的数据说明，炎性抑制抑制天然免疫应答是通过caspase-1介导的。

Fig3F- z-VAD-fmk是一个caspase的广谱抑制剂，当使用z-VAD-fmk处理THP-1细胞时，IRF3磷酸化与Viperin的表达量都上升。

Fig3F- z-VAD-fmk是一个caspase的广谱抑制剂，当使用z-VAD-fmk处理THP-1细胞时，IFN-I的生成上升，对于RNA病毒与DNA病毒都如此。

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Fig4A-胞质dsDNA能诱发cGAS合成cGAMP，而cGAMP能激活STING。由于caspase-1对抑制DNA病毒诱导的抗病毒有着重要的作用。因此作者假设，caspase-1能对cGAS或STING有抑制作用。作者先验证了caspase-1与cGAS或STIN是否有相互作用，结果显示，caspse-1与cGAS有相互作用，但是与STING无相互作用。此结果还显示，病毒感染，或炎性小体活化能降低cGAS的水平（看图WCL中的数据，cGAS的水平是降低的）。

Fig4B-病毒感染或炎性小体的活化，能增强caspase-1与cGAS的这种相互作用。

Fig4C-发现caspase-1与cGAS有相互作用这个现象后，作者研究了caspase-1的哪个结构域与cGAS有相互作用。结果显示，Caspse-1 p20片段与cGAS有相互作用。

Fig4D-使用Chloroquine和MG132抑制蛋白酶体和溶酶体通路后，cGAS降低。但是，使用VX765后，能换逆转这种效应。氯喹（Chloroquine）用于抑制细胞的蛋白酶体和溶酶体，MG132也是一种常用的Proteasome抑制剂，即蛋白酶体抑制剂，MG-132可以通透细胞，选择性抑制Proteasome。

Fig4E-使用shRNA敲低caspase1后，cGAS的表达能够恢复。由于caspse-1能割切很多蛋白，例如Mal和TRIF，作者在这里推测，caspase-1或许能够与cGAS相互作用，并切割cGAS。

Fig4F-LPS+ATP或者是病毒感染都能造成cGAS的明显切割。切割的标志就是

通过免疫沉积的方法，提取了人源cGAS，然后将其与细菌来源的caspse-1共同孵育，可以发现cGAS被切割为了一个较小的片段，由于纯化的cGAS是在C末端用Flag标记的，因此caspase-1是在N端对cGAS进行切割的。对caspse-1进行突变，或者是使用VX765进行干预后，这种切割并不会出现（参见附图）。

Fig4G-病毒感染也会导致caspase-1的切割。

Fig4H-LPS+ATP或LPS+rotenone会导致野生鼠源BMDM中鼠源cGAS的切割，而在casp敲除的BMDM中则不会出现这种切割。

Fig4I-LPS+ATP能导致iBMM中cGAS的切割。

Fig4J-293FT细胞转染C端标记，N端用HA标记的GAS，可以发现能够切割。

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前面数据作者证明了caspase-1能切割cGAS，但是具体的切割位点不清楚。接着作者研究了具体的切割位点。

Fig5A-有文献报道，敲除了cGAS的N端的160个残基（cGAS-dN）并不影响cGAS的活化，因此作者首选研究了cGAS-dN是否能够被切割。在iBMM中过表达Flag-cGAS-dN-GFP后，使用VACV或SeV感染，cGAS并没有出现切割，这说明，caspase-1切割人源cGAS的位点在N末端。

人源cGAS的N末端有6个天冬氨酸，分别为D33，D67，D90，D95，D140，D157，这是caspase-1酶作用的潜在靶点。作者分别通过丙氨酸来替换天冬氨酸，一共构建了6个突变体，它们都能诱导IFN-I的产生（这一处不太理解，为什么使用丙氨酸来替换天冬氨酸）将这6个突变体转入cGAS敲除的细胞后，然后用VACV来感染这6个突变体细胞，这六个突变体都能激活IRF3，IFN-I。

注：D33A表示第33个位点的D用A替换；D33/67A表示，第33个和第67个D位点被A替换。

Fig5B-在iBMM中过表达这6个突变体后，可以发现D33-140A cGAS这个突变体能够抑制caspase-1的切割。使用所有的6个丙氨酸来取代天冬氨酸后，能够完全抑制这种切割。

Fig5C-表达D33-140A，或D33-157A这两个突变后后，能够增强宿主细胞对DNA病毒的应答，同时还会出现cGAS切割现象的消失。

Fig5D-当每个天冬氨酸分别被突变后，可以发现，D140A或D157A或者是用组氨酸进行突变，即D140H或D157H，它们都能抑制病毒感染诱导的cGAS切割。联合突变DD/AA能完全阻断这种切割。附图中的数据表明，过表达这些突变，能诱导强烈的IFN-I活化。数据还显示，caspase-1能在N末端作用于m-cGAS。敲除这些N末端残基（m-cGAS-d6-165）能阻断这种切割。这些数据表明，caspase-1能在D140或D157位点靶向切割h-cGAS。

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前面作者发现了caspase-1切割cGAS的位点，接着作者研究了cGAS的这种切割能否影响cGAMP的产生。

Fig6A-LPS或MALP2刺激THP-1细胞，然后加或不加rotenone或ATP，再用VACV感染，提取cGAMP，分析cGAMP的活性。VACV的感染诱导cGAMP的产生这一过程受到了抑制，IRF3磷酸化也受到了抑制。

注：MALP-2最初是从发酵支原体（Mycoplasma fermentans）中提取的，它是发酵支原体细胞膜上的一种脂多肽，N端上连接着二软脂酰基，可以识别靶细胞上特异受体，产生多种免疫活性。体内、外实验均证实MALP-2可引起单核／巨噬细胞分泌多种细胞因子和趋化因子，并有促进破骨细胞的骨吸收作用。

Fig6B-在细胞中加入cGMAP后，能诱导THP-1细胞释放Viperin与IFN-I，但是，加入LPS+APT（诱导炎性小体活化）后，再用VACV感染，不产生IFN-I与Viperin。这些结果表明，炎性小体的活化会损伤cGAMP的产生。（cGAMP是由cGAS合成的，cGAMP再激活STING）。加入cGMAP后其实是恢复了炎性小体抑制的IFN-I的产生。

Fig6C-Casp敲除的小鼠的腹腔巨噬细胞能产生更多的cGMAP

Fig6D-Casp敲除的小鼠的BMDM能产生更多的cGMAP。

Fig6ABCD中的数据说明，caspase-1能抑制细胞cGAMP的产生。

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作者的研究发现了在炎性小体活性期间，h-cGAS能够在D140/175位点被caspase-1切割，导致cGAS功能的丧失，与以前的研究有冲突，这表明，h-cGAS N端160个残基对于cGAS功能来说不是必须的。为了阐明这种区别，作者在293FT中过表达了h-cGAS-dD或全长的h-cGAS。

Fig7A-Hela-cGAS-/-转染了hcGAS-WT，感染SeV或VACV，检测IFN-I。

Fig7B-Hela-cGAS-/-转染了hcGAS-d6-160aa，感染SeV或VACV，检测IFN-I。IFN的活化丧失。

Fig7C-此结果表明，cGAS N末端有着重要的作用。为了研究此区域的功能，作者构建了这一个区域不同的突变体。作者发现，在cGAS敲除前120个氨基酸后，不影响此区域的功能，这说明，此区域的120-160氨基酸是发挥功能的区域。

以前的研究发现，h-cGAS的N末端能够在体外与DNA结合，途径发现，h-cGAS的122到133，m-cGAS的119-132残基含有R与K氨基酸簇，它们含有丰富的正电荷，这对于蛋白质-DNA（DNA含有磷酸残基，而磷酸残基带负电）的相互作用来说有着重要意义。

Fig7D-富含R/K的区域也许能作为一个DNA结合区域，敲除这个区域后，用DNA病毒感染，发现了IRF3的磷酸化，Viperin都降低（RNA病毒则无此现象）。

Fig7E-用mcGAS-WT或mcGAS-d119-132aa转染HeLa-cGAS-/-后，再用SeV或VACV感染，突变组中的的IRF3，Viperin都下降。

需要补充的知识背景：

Caspase1，炎性小体，IFN-I