逆转录酶性质 – 六个关键注意事项

DNA聚合酶活性
RNase H活性
热稳定性
持续合成能力
保真度
末端核苷酸转移酶（TdT）活性

逆转录酶是从RNA模板合成互补DNA（cDNA）链过程中的必需试剂。因此，深入地了解这些酶的性质及其对逆转录的影响，对分子生物学实验的成功至关重要。

DNA聚合酶活性

逆转录酶是由不同生化活性的不同结构酶组成。尽管不同生物体来源的逆转录酶功能存在或多或少的差异，包括如DNA依赖性DNA聚合酶活性，但逆转录酶的主要功能仍取决于RNA依赖性DNA聚合酶和RNase H酶活性。如图1所示，逆转录过程通常涉及许多步骤：

1、在存在退火引物的条件下，逆转录酶结合到RNA模板并引发反应。
2、RNA依赖性DNA聚合酶活性通过掺入dNTPs合成互补DNA链。
3、RNase H活性降解DNA:RNA复合物中的RNA模板。
4、DNA依赖性DNA聚合酶活性（如果存在)识别单链cDNA作为模板，使用RNA片段作为引物，合成第二链cDNA。
5、形成双链cDNA。

图1、逆转录过程

RNase H活性

如上所述，逆转录酶的一个内在特性是RNase H活性。后者可以在合成过程中同时切割RNA：cDNA杂合链中的RNA模板^[1]（图2）。由于RNA模板在全长逆转录完成之前可能被降解，RNase H活性是长片段cDNA合成过程中需要规避的因素。 RNase H活性还可能降低逆转录效率，这可能是因为其会与逆转录酶中的活性聚合酶竞争。

图2、cDNA合成过程中逆转录酶中的RNase活性

为了更好地合成cDNA，通过在逆转录酶的RNase H结构域中引入突变，逆转录酶的RNase H活性降低甚至完全消除。这种突变常常可以增加长链cDNAs的产量，促进其合成（图3）^[2]。

图3、 RNase H活性对cDNA合成的影响。使用具有或不具有RNase H活性的逆转录酶，在相同反应条件下，逆转录9.5kb，7.5kb和5.2kb的mRNA。结果表明，无RNase H活性的逆转录酶可更高效地产生全长cDNA。 M =标准长度DNA

热稳定性

逆转录酶耐受高温的能力是cDNA合成的重要影响因素。升高反应温度有助于使具有坚固二级结构和/或高GC含量的RNA变性，使得逆转录酶能够读取序列。因此，在较高反映温度下的逆转录能够实现全长cDNA合成，产量更高，进而使RNA能够更好地逆转录为cDNA^[3,4]。

与野生型MMLV逆转录酶相比，野生型AMV逆转录酶展现出更高的热稳定性——二者最适宜的温度分别为42-48℃和37℃。一些经过基因工程改造的MMLV逆转录酶可以耐受55℃的高温，但逆转录效率没有明显的改变（图4）。这种高度耐热的逆转录酶特别适用于从富含GC的RNA模板合成cDNA。

图4、不同反应温度下的逆转录过程。使用高度耐热、经过基因工程工程改造的MMLV逆转录酶，在不同温度下逆转录不同长度的RNA模板。通过NaOH处理除去RNA模板，利用变性琼脂糖凝胶电泳分析得到的cDNA。结果表明，即使在56.4℃下，热稳定性酶依然具有100％活性。

使用一步法RT-PCR中的基因特异性引物较高温度下的逆转录，增强引物与目标基因结合的特异性。该策略可以在随后的PCR中增加产量和降低背景干扰（图5），使用热稳定性的逆转录酶更适合cDNA合成。

图5、高反应温度下的逆转录增强了PCR特异性。使用oligo（dT）20（12.3kb mRNA）或基因特异性引物（9.3kb，7kb和5.5kb mRNA）在更高温度下逆转录四种不同基因的mRNA。在55℃反应温度下的逆转录， RT-PCR中的目标片段产生更高的特异性。

持续合成能力

逆转录酶的合成能力是指结合到酶的单一结合位点中的核苷酸数目。因此，合成能力高的逆转录酶可以在更短的反应时间内合成更长的cDNA链（图6）。一些基因工程改造的MMLV逆转录酶在单个结合位点中可以结合多达1,500个核苷酸，结合能力大概是野生型MMLV逆转录酶的65倍^[5]。

图6、逆转录酶的合成能力可以影响整个cDNA长度

酶合成能力也与其对模板的亲和力有关。因此，具有高合成能力的逆转录酶对可能来源于RNA的常见抑制剂具有抗性。逆转录酶的抑制剂包括来自血液和粪便的肝素和胆汁盐，来自土壤和植物的腐殖酸和多酚，以及来自福尔马林固定，石蜡包埋（FFPE）样品的福尔马林和石蜡。这些抑制剂通常与RNA结合和/或降低合成活性^[6]，高合成能力的逆转录酶能够更好地克服这种抑制（图7）。

在面对低质量和低丰度的RNA样品时，高合成能力的逆转录酶仍然表现更好^[7]。该属性使得高合成能力的逆转录酶是研究分离自植物、动物和临床试验样品的RNA的理想酶，因为这些样品容易在处理和富含RNase的环境中被降解。同样，当RNA的量有限时，这些酶也是实验的不错选择。

图7、高合成能力的逆转录酶使用含有抑制剂的RNA样品或已经降解的RNA样品进行cDNA合成时的效果。A）使用含有常见生物来源的酶抑制剂（例如来自FFPE样品的福尔马林，来自血液的血红蛋白和肝素，来自血液和粪便的胆汁盐）的RNA进行逆转录。通过碱性凝胶电泳，分析合成的cDNA。具有高合成能力（H）的逆转录酶在cDNA合成中比低合成能力酶（L1-L4）的cDNA合成效率更高。（B）通过凝胶电泳评价从不同植物来源纯化的总RNA。高质量RNA（RIN> 8）显示不同的rRNA条带，而降解的RNA（RIN1-3）主要由弥散和/或较小的RNA片段组成。使用高合成能力的逆转录酶（H）或低合成能力（L3，L4）的逆转录酶将已经降解的RNA在随机六聚体下进行逆转录。用所得的cDNA进行qPCR获得特定的目标基因。通过将所有Ct值与具有高持续性的逆转录酶的Ct值标准化来确定逆转录效率。 H =高合成能力，L =低合成能力，RIN = RNA完整性数。

保真度

逆转录酶的保真度指的是RNA逆转录为DNA过程中的序列精确度。保真度与逆转录错误率成反比。据报道，基于MMLV的逆转录酶错误率在合成15,000到27,000个核苷酸中有一个错误核苷酸，而AMV逆转录酶表现出更高的错误率^[8-10]。

逆转录酶的保真度可能在RNA测序等序列准确度至关重要的情况下发挥重要作用。对于大多数其他情况，逆转录中引入的错误数量可以忽略不计，主要原因有两个：大多数基因短于10 kb，逆转录过程不会放大cDNA中的错误。

末端核苷酸转移酶（TdT）活性

逆转录酶可展现出末端核苷酸转移酶(TdT)活性，这会导致向合成的DNA3'末端非模板特异性的添加核苷酸。TdT活性仅在逆转录酶接触到RNA模板5'末端才会表现出来，此时其会向cDNA末端添加1-3个额外的核苷酸，并且对双链核酸底物（如第一链cDNA合成中的DNA：RNA和第二链cDNA合成中的DNA：DNA）展现出特异性。通常来说，这种内在活性是逆转录过程所不需要的，因为加入的核苷酸与模板不对应。非模版特异性核苷酸加入顺序通常为A>G≥C>T^[9,11]。

不同的逆转录酶具有不同的内在TdT活性。使用野生型MMLV和AMV逆转录酶，25-90%的合成DNA链可能在3′含有额外的核苷酸。另一方面，经过基因改造的MMLV逆转录酶展现出较低的内在TdT活性。除逆转录酶外，核苷酸加入速率还取决于反应条件，如RNA：酶的比例、酶的量、孵育时间和反应温度^[9]。

对于特定情况如全长cDNA克隆，cDNA末端的快速扩增（RACE）和RNA测序（RNA-Seq），可以诱导逆转录酶特异性地向cDNA3′末端加入一系列Cs。在高浓度镁和/或锰离子条件下的cDNA合成期间及合成后阶段，这种类型的TdT活性会被触发^[12,13]。结合特殊设计的具有3’Gs(称为模板切换寡核苷酸)的DNA寡核苷酸，TdT活性可以特异性地修饰3’cDNA末端和5′ RNA末端（图8）。这些序列修饰的实例包括引入用于随后cDNA合成步骤的限制性位点和/或用于下游RNA测序步骤的接头添加^[14-16]。

图8、逆转录酶引入的非模版特异性核苷酸对3’cDNA末端的修饰。.png

如本节所讨论的，可通过开发和调节逆转录酶内在特性，进行成功的cDNA实验。除了开展自身用途（包括遗传多样性和逆转录病毒的复制）的研究之外，逆转录酶也被证明是分子生物学家用于其他各种应用（如基因表达分析和cDNA测序）的重要工具。

参考资料：

a. 逆转录酶性质 – 六个关键注意事项