https://www.nature.com/articles/s41421-020-0168-9
影响因子： 6.255PMID：32377375期刊年卷：Cell Discov 2020;6 生物二区 细胞生物学 Q2 60/190
DOI：10.1038/s41421-020-0168-9
概要
使用单细胞测序，作者分析了血液中免疫种群的复杂性，并分析了10位患者的70,858个细胞。作者确定了ERS患者的高炎症反应，这可以解释为什么某些患者出院后生病，并建议应重新评估当前的出院标准。此外，作者鉴定了髓样，NK，T和B细胞的独特标志，并指出了TCR和BCR表位的变化。作者的发现有助于阐明抗病毒免疫机制，并揭示了使用疫苗和中和抗体开发免疫疗法的有希望的机会。
研究重点
- 在检测到COVID-19阴性后，免疫反应持续了7天以上
- COVID-19感染后患者外周血中经典炎性单核细胞（CD14 ++ IL1b +）的比例增加
- ERS患者中CD4中央记忆T细胞的分数增加，而与LRS患者的健康对照者相比减少
- ERS患者浆细胞比例增加，LRS降低
- 从ERS到LRS的时间段内发生IgA到IgM抗体的类别转换
- 鉴定COVID-19后患者的主要IGV基因，这可能对疫苗开发有用
研究影响
用于了解SARS-COV-2清除后的免疫细胞组成（来自PBMC）
回顾性了解免疫细胞反应并告知可能的疫苗设计/药物靶标
用于识别康复患者的免疫特征
方法
作者将患者区分为早期康复阶段（n = 5，ERS，自从对COVID19呈阴性以来<7天）和晚期康复阶段（n = 5，LRS，> 14天），并将这些患者与健康对照组进行比较（n = 5）
PBMC的单细胞RNA测序
scBCR-seq和scTCR-seq评估扩增的B细胞和T细胞克隆的克隆性
计算方法没有得到很好的描述，因此某些数字并未直接突出显示得出的结论
使用的某些工具不是标准的工作流程工具，因此需要在方法中进行进一步说明
本文的优缺点
优点：
- 在疾病的不同阶段使用人类患者（健康对照，ERS和LRS）
- 健壮的患者和健康对照组（每组5个样本；年龄匹配）
- 结合不同方法（scRNA-seq，scTCR-seq和scBCR-seq）表征免疫细胞组成和可能的功能
- 比较ERS与LRS，以了解免疫清除和治疗策略
- BCR链的出现可能对疫苗开发很重要
缺点：
- 仅康复患者正在进行疾病的机制
- 仅血液，无肺组织或肺液（BAL）对机制主张很重要
- 描述性的，未验证结果
- 使用的计算方法不是最先进的或描述得不好的
- 方法不够详细，无法重现分析结果
- 注释不佳的数字很难得出结论
- 未进行统计检验，但发现声称“重要”
摘要
由SARS-CoV-2引起的COVID-19最近影响了1,200,000多人，造成60,000多人丧生。关键的免疫细胞亚群发生变化，其在COVID-19过程中的状态仍不清楚。作者试图通过单细胞RNA测序技术全面表征COVID-19恢复期外周血单个核细胞的转录变化。发现在COVID-19的早期恢复期（ERS）中，患者的T细胞显著减少，而单核细胞增加。具有较高炎症基因表达的经典CD14 ++单核细胞比例增加，并且ERS中CD14 ++ IL1β +单核细胞的丰度更高。CD4 + T细胞和CD8 + T细胞显著减少，并在ERS中表达高水平的炎症基因。在B细胞中，浆细胞显著增加，而幼稚B细胞减少。确定了几个新的B细胞受体（BCR）的变化，例如IGHV3-23和IGHV3-7，并确认了以前用于病毒疫苗开发的同种型（IGHV3-15，IGHV3-30和IGKV3-11）。最强的配对频率IGHV3-23-IGHJ4表示与SARS-CoV-2特异性相关的单克隆状态，尚未有报道。此外，综合分析预测，IL-1β和M-CSF可能是炎性风暴的新型候选靶基因，而TNFSF13，IL-18，IL-2和IL-4可能对COVID-19患者的康复有益。作者的研究提供了ERS中炎症性免疫信号的第一个证据，提示出院后COVID-19患者仍然易受伤害。新的BCR信号转导的鉴定可能导致开发用于治疗COVID-19的疫苗和抗体。
结果
1.COVID-19患者单免疫细胞谱分析的研究设计和分析
为了绘制COVID-19患者的免疫微环境图，作者鉴定了血液中的镜像变化，并查明了与疾病严重程度和恢复相关的细胞特异性变化。然后，作者从早期恢复阶段（ERS）或晚期恢复阶段（LRS）（70,858 PBMC）的总共10例COVID-19患者中整合了scRNA-seq，单细胞配对BCR和单细胞配对TCR分析。作者还从五个健康供体作为对照收集了scRNA-seq数据（57,238个细胞）（图1a** 和补充图S1a–c）。**该数据集通过了严格的高质量过滤。使用10x Genomics将scRNA-seq样品的单细胞悬液转化为条形码的scRNA-seq库。Cell Ranger软件（版本3.1.0）用于测序数据的初始处理。
图1：COVID-19患者单免疫细胞谱分析的研究设计和分析
作者使用t分布随机邻居嵌入（t-SNE），根据典型谱系标记物和在每个簇中上调的其他基因的表达，分析了三种免疫细胞谱系，髓样，NK，T和B细胞的分布（图1b，c）。对于标记基因，位于t-SNE中的每个细胞中的表达值如图1d所示。接下来，作者分别将每个谱系的细胞聚类，并鉴定出总共20个免疫细胞簇。
2. 康复期COVID-19患者血液中的NK和T，B和髓样细胞概述
从COVID-19感染中恢复过来的患者的免疫细胞区包括所有主要的免疫谱系。作者分析了通过质量控制的128,096个scRNA-seq概况，包括来自五个HC，五个ERS和五个LRS患者的36,442个髓样细胞，64,247个NK和T细胞以及10,177个B细胞。补充图S2a中显示了每个主题的粗略聚类分析景观，图2a中显示了每个组的合并图像。作者发现，与HCs相比，包括ERS和LRS在内的COVID-19患者的髓样细胞比例更高，但NK和T细胞比例更低（图2b，c）。有趣的是，与ERS患者相比，LRS患者的B细胞，NK和T细胞更多，但髓样细胞却更少（图2b，c）。因此，这些发现表明COVID-19患者外周血中淋巴细胞计数降低，而髓样细胞计数升高。
图2：恢复期COVID-19患者的血液中的NK，T，B和骨髓细胞概述
3.恢复期COVID-19患者血液中的髓样细胞亚群及其状态
为了进一步了解COVID-19恢复早期和晚期患者中单核细胞的变化，作者进行了基因表达分析，并使用统一流形近似和投影（UMAP）将髓样细胞亚群化为六个转录不同的亚群。
经典CD14 ++单核细胞（M1），
非经典CD16 ++（FCGR3A）CD14- / +单核细胞（M2），
中间CD14 ++CD16 +单核细胞（M3），
CD1C + cDC2（M4），
CLEC9A + cDC1（M5 ）和
pDC（CLEC4C +CD123 +）（M6）
存在于六个不同的簇中（图3a，b）。作者发现在HCs和COVID-19患者之间，单核细胞亚群的区室显著不同（图3c）。在髓样细胞中，ERS患者中经典CD14 ++单核细胞（M1）的比例高于HCs，而LRS患者中则几乎是正常的（图 3c）。
图3：恢复期COVID-19患者血液中的髓样细胞亚群及其状态
作者发现，COVID-19患者的CD14 ++ IL1β +单核细胞和IFN激活的单核细胞比HCs富集（图3d–f）。与CD14 ++炎性单核细胞（M1）相关的基因具有高表达水平的炎性基因，例如IL1β，JUN，FOS，JUNB和KLF6。趋化因子CCL4，CXCR4 ; 以及干扰素刺激的基因IFRD1，IRF1和IFI6。相比之下，与HCs中的CD14 ++单核细胞（M1）相关的抗炎基因在COVID-19患者中被下调（图 3d，e）。值得注意的是，UMAP中的IL1β表达值同时具有对比，表明ERS组中IL1β上调，而LRS患者中IL1β下降（图3f）。与HCs相比，ERS组的DC集群中也证实了这一点（补充图S3a，b）。接下来，作者获取了COVID-19患者与HCs中每个髓样细胞scRNA-seq亚型的平均炎症基因（补充图S3c）。这些结果表明，细胞因子的激活驱动单核细胞群的扩展（尤其是CD14 ++感染COVID-19的患者中的炎性单核细胞）。为了探索M1簇中转录变化的生物学意义，作者用DEG进行了GO分析（图3g）。作者观察到与细胞因子信号传导和炎症激活相关的途径的富集，这是由IFITM3和IFI6和IL1β，JUN，FOS，JUNB和KLF6的上调驱动的（图 3g）。
总体而言，这些发现表明，ERS患者单核细胞群中失调的平衡表现为经典CD14 ++单核细胞的大量增加。作者的结果表明， 在SARS-CoV-2感染过程中，经典的CD14 ++单核细胞循环增加，从而加剧了炎症。
4. 恢复的COVID-19患者血液中T细胞和NK细胞反应的特征
T细胞和NK细胞在呼吸道感染中发挥病毒清除关键作用15，16。作者的聚类分析基于规范标记（图4b和补充图S4a）将T和NK淋巴细胞分为10个子集（图4a）。
NK细胞高表达NCAM1，KLRF1，KLRC1和KLRD1 ;
（1）NK细胞细分为CD56 + CD16 - NK细胞（NK1），它们表达高水平的CD56 和低水平的CD16；
（2）C56 - CD16 + NK细胞（NK2），它们表达高水平的CD16 和低水平的CD56。
CD4 + T细胞表达CD3E和CD4 ; 然后将这些细胞细分为四个簇：
（1）幼稚的CD4 + T细胞（T1），它们表达高水平的CCR7，LEF1和TCF7；
（2）中央记忆CD4 + T细胞（T2，CD4 Tcm），表达高水平的CCR7，但与单纯CD4 + T细胞相比，AQP3和CD69更高；
（3）效应器记忆CD4 + T细胞（T3，CD4 Tem），表达高水平的CCR6，CXCR6，CCL5和PRDM1;
（4）调节性T细胞（T4，Treg），表达FOXP3。
CD8 + T细胞表达CD8A和CD8B，并细分为三个簇：
（1）幼稚CD8 + T细胞（T5），其表达高水平的CCR7，LEF1和TCF7，与幼稚CD4 + T细胞相似；
（2）效应记忆CD8 + T细胞（T6，CD8 Tm），表达高水平的GZMK；
和细胞毒性CD8 +淋巴细胞（CD8 +CTL）（T7），它们表达高水平的GZMB，GNLY和PRF1。
（3）增殖性T细胞（T8，T prol）是TYMS +MKI67 +细胞。
图4：恢复的COVID-19患者血液中T和NK细胞反应的特征。
在HCs和COVID-19患者之间，T细胞和NK细胞亚群的组成存在显著差异（图4c）。在COVID-19患者中，CD8 + T细胞的绝对数量，特别是效应记忆CD8 + T细胞亚组和NK细胞的绝对数量减少，而ERS中NK细胞的相对比例高于HCs。CD4 + T细胞的比例是稳定的，但HCs和COVID-19患者之间CD4 + T细胞亚群的组成存在显著差异。在CD4 + T细胞中，中央记忆CD4 + T细胞的比例明显更高，而幼稚CD4 + T细胞，Tregs和效应记忆CD4的比例+ T细胞低于HCs，尤其是ERS组。值得注意的是，与CD4 + T细胞相关的基因具有较高的炎症相关基因表达水平，并且在COVID-19患者中明显上调（图4d）。CD4 + T细胞在COVID-19的ERS患者中具有高表达水平的炎症基因，包括FOS，JUN，KLF6和S100A8（图4e）。相反，COVID-19患者的CD4 + T细胞相关的抗炎基因相对于HCs被下调（图 4d，e）。这表明CD4 +T细胞是病毒感染的主要参与者。CD4 + T细胞中DEG的比较揭示了参与细胞因子途径和炎症激活的基因的丰富，包括IFITM3和IFI6以及IL1B，JUN，FOS，JUNB和KLF6（图 4f）。需要进一步的研究阐明与COVID-19发病机制有关的IFN途径。
TCR-seq分析显示，ERS组的T细胞扩增明显低于HC组（图4g）。此外，幼稚或中枢记忆T细胞几乎没有克隆扩增，而效应记忆T细胞，末端效应CD8 + T细胞（CTL）和增殖T细胞则显示出更高的扩增水平（图4h）。另外，ERS组中扩增最高（最大）的克隆是TRAV8-6-TRAJ45：TRAV7-8-TRBJ2-1（补充图S5d）。COVID-19患者中CD8 + T细胞比例的降低可能暗示了CD8 + T细胞在病毒清除中的作用（图 4c）。而且，CD8 +与HCs中的克隆相比，具有扩展克隆的CTL还表现出过度活化的炎症和抗病毒活性（图 4i和补充图 S4b）。总之，这些发现表明COVID-19患者外周血中CD8 + T细胞的克隆扩增有助于控制该病毒。作者还通过Seurat FindAllMarkers 分析进行了DEG分析，并在T prol细胞中发现了相似的结果（补充图S4c）。接下来，作者将COVID-19患者中每个NK和T细胞亚群scRNA-seq子集的炎症基因与正常RNA-seq数据的平均值进行比较（补充图 S4d）。
5. COVID-19患者的单细胞B细胞特征
通过使用扩散图预测B细胞的基因表达数据，作者使用
scRNA-seq鉴定了四个B细胞簇：
表达CD19，CD20（MS4A1），IGHD，IGHM，IL4R和TCL1A的幼稚B细胞（B1）；**
表达CD27，CD38和IGHG的记忆B细胞（B2）; **
仅表达CD19和CD20（MS4A1）的未成熟B细胞（B3 ）；**
以及表达高水平XBP1和MZB1的浆细胞（B4）（图5a，b和补充图S5a）**。
图5：在COVID-19患者中单细胞B细胞的表征。
与HCs相比，COVID-19患者的浆细胞百分比显著增加，而COVID-19患者的幼稚B细胞百分比显著降低（图5c）。记忆B细胞和浆细胞（MPB）可能在病毒感染的控制和过继免疫的发展中起重要作用，因为它们协同工作并诱导特异性抗体。此外，与HCs相比，包括S100A8，IGLL5，SSR3，IGHA1，XBP1和MZB1在内的B细胞活化相关基因主要在ERS组的MPB中表达（图5d）。作者还在浆细胞，抗体分泌细胞（ASC）中发现了类似的结果（补充图S5b，c），提示ASC在病毒控制中起关键作用。接下来，作者将COVID-19患者每个B细胞亚群的炎症基因平均值与正常RNA-seq数据进行比较（图5e）。ERS和HCs之间的基因差异表明COVID-19患者的B细胞反应和抗体分泌增强。GO分析表明，MPHA中IGHA1，XBP1，MZB1，JUN，POLR2L和ZFP36的表达过高，这表明COVID-19患者的B细胞增殖和病毒转录增强（图5f）。单细胞BCR-seq分析表明，与HC中相比，COVID-19患者中IgA同种型的表达过高（图5g））。这与血清IgA水平升高相对应，这在其他冠状病毒感染中也很明显。此外，在ERS患者中，（IgA + IgG + IgE）与（IgD + IgM）的比例显著增加，并且随着恢复时间而呈下降趋势（图5h）。
6. 在COVID-19患者中观察到BCR克隆扩增和VDJ基因使用偏倚
使用sc-BCR-seq评估患者血液中克隆扩增的状态，作者发现IL4R +幼稚B细胞显示出很少的克隆扩增，而CD27 + CD38 +记忆B细胞显示出在各种B细胞亚群中最高的扩增水平（图 6a）。在个体水平上，作者发现与HCs相比，COVID-19患者的克隆明显扩增，这支持了B细胞在SARS-CoV-2感染下经历了独特的VDJ克隆重排的假设。作者还发现，与LRS患者相比，ERS中始终保持较高的B细胞克隆性（图6b）。）。此外，对每个受试者的最大扩增（最大）克隆的定量显示，ERS组中最大克隆的比率高于HCs中的最大克隆的比率（图6c）。为了了解扩增的克隆B细胞的功能状态，作者在克隆的记忆B细胞和其他B细胞之间进行了DEG分析。作者的结果表明B细胞基因的表达增加，包括CD27，SSR4，IGHG1，MZB1和XBP1，这进一步支持了扩增的克隆B细胞的优异效应子功能（图 6d）。而且，随着时间的流逝，扩增的B细胞的差异基因会明显消退，而在LRS患者中会降低（图6d）。
图6：在COVID-19患者中观察到BCR克隆扩增，VDJ基因使用偏倚。
为了研究COVID-19患者中BCR的独特变化和偏好基因，作者比较了COVID-19患者和HCs中VDJ基因的使用情况。作者确定了IGHV3家族的过度表达，COVID-19患者相比尤其是在IGHV3-7，IGHV3-15，IGHV3-21，IGHV3-23和IGHV3-30 （图6E）。优选的IGKV是IGKV1-17，IGKV2-28和IGKV3-15，而优选的IGLV是IGLV1-44，IGLV2-8和IGLV3-27（图6e）。此外，ERS患者的前两个配对频率是IGHV3-23-IGHJ4和IGHV3-7-IGHJ6（图6f））。这些细胞显示出IGH亚基与分别由IGLV1-44-IGLJ3和IGKV1-17-IGKJ1编码的IGK / L亚基配对，这表明与SARS-CoV-2特异性相关的扩展状态。单独地，ERS-4和ERS-5具有最大的克隆，分别参考IGHV3-23-IGHJ4（补充图S5e）和IGHV3-7-IGHJ6（补充图S5f）。
总之，以IgA和IgM同种型为主的COVID-19克隆性的增加，以及IGHV基因的偏斜使用，提示SARS-CoV-2对发病机理的贡献。值得注意的是，COVID-19患者中主要IGV基因（尤其是IGHV3-23和IGHV3-7）的偏好为合理设计SARS-CoV-2疫苗提供了框架。
7. COVID-19患者免疫细胞之间的细胞间通讯
用于预测可能有助于ERS和LRS中T细胞，B细胞，单核细胞和树突状细胞（DC）不同功能状态的细胞间相互作用（图 7a，b）。在ERS COVID-19患者中，作者发现了与单核细胞激活，增殖和炎症信号有关的适应性信号（图7a，b）。
T细胞表达的基因编码TNFSF8，LTA，IFNG，IL17A，CCR5和LTB的配体与TNFRSF8，TNFRSF1A / TNFRSF14，IFNGR1，IL-17RA，CCR1和LTBR的配体相关，这些基因在单核细胞上表达，可能有助于促炎状态。其他T细胞-单核细胞相互作用涉及CSF2和CSF1的表达。
T细胞可能通过CSF2和CSF1的表达激活单核细胞，而CSF2和CSF1与CSFR（CSFR2 / 1）结合并促成炎性风暴。CD14 +单核细胞簇仅表达IL1β，据预测它将与T细胞表达的IL1RAP结合。T细胞与单核细胞的相互作用可能会增强免疫应答，并且仅针对COVID-19患者（图7a，b）。
此外，作者发现单核细胞高表达脊髓灰质炎病毒受体，在脊髓灰质炎病毒复制和诱导NF-κB信号传导的第一步中，它作为脊髓灰质炎病毒的细胞受体。从B细胞单核细胞和B细胞T细胞的相互作用中，作者发现B细胞可以分泌大量IL-6，LTA和LTB，并与在单核细胞中表达的IL-6R，LTAR和LTBR结合，大量的IL-6应用于T细胞，以促进IFN-γ，IL-1β和其他炎症细胞因子和趋化因子的分泌。因此，在ERS COVID-19患者的发病高峰中形成了高表达IL-6及其后代的炎性单核细胞的级联特征（图7c）。这些活化的免疫细胞可能大量进入肺和其他器官的循环，并发挥免疫破坏作用。
在LRS COVID-19患者中，预计DC配体会与参与细胞增殖和抗体产生的B和T细胞受体相互作用。作者发现LRS患者的外周血含有多种抗体。作者发现，在作者对DC-B细胞相互作用的分析中，IL18-IL18RAP，TNFSF13-TNFRSF13B，TNFSF13-TNFRSF17，TNFSF13B-TNFRSF17，TNFSF13B-TNFRSF13B和TNFSF13B-TNFRSF13C高度表达（图7d）。因此，作者推测DC产生IL-18，TNFSF13和TNFSF13B来促进B细胞的增殖，然后在ERS的血液中分泌许多抗体。
从DC-T和T细胞-B细胞的相互作用中，作者发现DC不仅产生IL-18，而且产生IL-7以促进T细胞的增殖。此外，T细胞产生IL-2以促进B细胞的增殖和抗体产生（图7d）。因此，细胞间的相互作用有助于作者理解为什么COVID-19患者表现出高单核细胞率和低淋巴细胞率，以及为何康复患者外周血中淋巴细胞的比例逐渐增加。
图7：在COVID-19患者中免疫细胞之间的细胞间通讯。
总结
使用单细胞测序，作者分析了血液中免疫种群的复杂性，并分析了10位患者的70,858个细胞。作者确定了ERS患者的高炎症反应，这可以解释为什么某些患者出院后生病，并建议应重新评估当前的出院标准。此外，作者鉴定了髓样，NK，T和B细胞的独特标志，并指出了TCR和BCR表位的变化。作者的发现有助于阐明抗病毒免疫机制，并揭示了使用疫苗和中和抗体开发免疫疗法的有希望的机会。
