1. 建库及全流程原理参考illumina测序介绍

NGS006 illumina测序

2. MGISEQ介绍

华大智造基因测序仪采用先进的DNBSEQTM测序核心技术，主要包括:DNA单链环化，DNB制备，规则阵列芯片（Patterned Array），DNB加载，cPAS（combinatorial Probe Anchor Synthesis联合探针锚定聚合测序法）,双端测序技术，CoolMPS，以及配合的流体和光学检测技术和碱基识别算法等。

3. 测序原理

• 华大MGI文库构建过程，采用泡状接头及与之相对应的扩增引物。与illumina相似，接头也同样具有长接头及短接头，单端及双端index，此部分详见illumina文库构建
• 文库构建流程及原理详见illumina文库构建

4. 文库制备

过程

以单链环状DNA为模板，在DNA聚合酶作用下进行滚环扩增（Rolling circle amplification, RCA），将单链环状DNA扩增到约500拷贝扩增产物称为DNB。基于RCA的线性扩增技术，每次扩增都是以原始的DNA单链环为模板，使用保真性极高的聚合酶（phi29 DNA polymerase），使得在DNB的所有拷贝的同一个位置上出同样的错的几率几乎是零。RCA扩增技术有效的避免了PCR扩增错误指数积累的问题，从而大大提高测序的准确性

DNB合成

文库环化

将带有接头序列的双链DNA（double-stranded DNA，dsDNA），通过高温变性形成单链DNA （single-stranded DNA，ssDNA），环化引物与ssDNA的两端互补配对，在连接酶的催化下，ssDNA的首尾相连接，形成单链环状DNA。

ssDNA环状单链文库

RCA扩增生成DNB

通过RCA扩增，可以将1copies原始ssCirDNA文库分子扩增得到约500copies

滚环扩增

Patterned array flowcell

采用先进的半导体精密加工工艺，在经过修饰的硅片表面形成结合位点阵列（spot直径约200nm），实现DNA纳米球（约220-240nm）的规则排列吸附。阵列芯片修饰位点的间距均一（约700nm），每个位点只固定一个DNB，可保证不同纳米球的光信号不会互相干扰，这不仅保证了测序准确度，而且提高了测序芯片的利用效率

Patterned array flowcell

DNB loading

DNB在酸性条件下带负电，在表面活化剂的辅助下，通过正负电荷的相互作用，被加载到芯片中有正电荷修饰的活化位点（直径约200nm）的过程，称为DNB加载。DNB直径略大于芯片上活化位点的直径，避免了多个DNB结合到同一个位点的情况

DNB加载

5. 测序

cPAS 流程

cPAS流程

正向read1测序

DNB含有约500 DNA fragment copies，也即可以与500条Read1引物退火结合，进行一链cPAS测序。

一链测序

二链测序

• MDA扩增原理（Multiple displacement amplification）

  
  
  多重置换扩增

• 在Read1测序结束后，DNA会继续延伸，此时处于上游的Read1引物延伸链，在遇到下游紧邻的Read1引物延伸的双链时，Phi29 DNA polymerase会将其置换下来，并继续延伸。当被置换下来的延伸链长度超过1copies，则会暴露末端的Read2引物结合位点，通常一链结束后，会继续向前合成延伸3-5 copies，被置换的大量单链DNA即为二链的模板，此时Read2引物即可以退火结合在被置换出来的延伸链上进行二链cPAS测序，而且二链的copies更多，荧光信号会比一链信号更强。

  
  
  二链测序

Barcode测序

index 测序

CoolMPS

• cPAS与CoolMPS
  传统的cPAS与illumina SBS一样，使用的dNTP都是3’-block reversible terminator，也是华大与illumina的重点专利纠纷，华大智造在2019年3月美国AGBT大会上发布了一种新的核苷酸标记技术-CoolMPSTM，该技术也是基于3’-O blocker reversible terminator，但是4种荧光是标记在了可特异性识别3’-O blocker碱基的抗体上，当测序结束，采集完荧光信号以后，3’-O-blocker被切除，荧光标记会随抗体一起脱落，这样碱基就变成了天然无修饰的状态引入DNA链，也就说CoolMPSTM确实是一种无损碱基合成技术

  
  
  cPAS对比

• CoolMPS测序原理
  CoolMPS实质上可以理解为联合探针锚定聚合技术（cPAS, Combinatorial Probe-Anchor Synthesis，或称为StandardMPS）的升级版，它使用的核苷酸是碱基上未标记荧光的dNTPs（cold dNTPs）。coolMPS由于dNTP仅有3’ blocker可逆封端，荧光标记在特异性抗体上，在DNA的合成过程中会随着3’-blocker被切除，相当于加入的每一个dNTP都是天然状态，而传统的cPAS及illumina SBS使用的dNTP除了3’ blocker之外，还有在碱基上修饰有荧光标记，在切除荧光标记之后，会有linker残留，并会随着DNA的测序不断积累，进而影响DNA聚合酶的活性，也就是所谓的“马拉松效应”，illumina称之为Phasing/Prephasing，而MGI称之为lag/runon。所以与之相比，CoolMPS具有更低的测序错误率，更好的测序质量及更高的数据产量。

  
  
  CoolPAS测序原理

• CoolMPS测序流程

  
  
  CoolPAS测序流程

华大 Protocol

以华大测序反应通用试剂盒为例（环化部分）

PCR文库纯化后质检

使用 Qubit® dsDNA HS Assay Kit或 Quant-iT PicoGreen® dsDNA Assay Kit等双链 DNA荧光定量，按照定量的操作说明对 PCR纯化后产物进行定量。要求最终 PCR产 物的摩尔量≥1 pmol，请参照如下公式 1进行计算，例如 ：主带 300 bp的打断产物 ，PCR产物主片段大小产物主片段大小 384 bp，其产量应达到产量应达到 250 ng。如需将多个样本混合测序，建议根据 MGIEasy DNA Adapters说明书使用规则设计混合方案（参照附录 B），在定量后进行不同 Adapters样本混合，样本混合后总量为 1 pmol，总体积 ≤48 μL。
1 pmol PCR产物对应的质量（ng）=（DNA主片段大小/bp）/1000bp×660ng
通过 Bioanalyzer、Tapestation (Agilent Technologies)；LabChip® GX、GXII、GX Touch
(PerkinElmer)；Fragment AnalyzerTM (Advanced Analytical)等基于电泳分离原理的设备对 PCR 纯化后产物进行片段分布检测。

变性

• 根据 PCR 产物主片段分布，取 1 pmol PCR 产物至新的 0.2 mL PCR 管中，用 TE Buffer 补充至总体积 48 μL。
• 将上述 PCR 管置于 PCR 仪上，按照下表的条件进行反应：1）热盖，On；2）95℃，3min
  -反应结束后，立即将 PCR 管转移到冰上，静置 2 min 后瞬时离心。

单链环化

• 在冰上配制单链环化反应液：

  
  
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• 用移液器吸取 12.1 μL 配制好的单链环化反应液加入4.2.3 中的PCR 管，涡旋震荡 3 次，每次 3 s，瞬时离心将反应液收集至管底。
• 将 PCR 管置于 PCR 仪上，按照下表的条件进行反应：1）热盖，On；2）37℃，30 min；3）4℃，hold
• 反应结束后，瞬时离心，将 PCR 管转移到冰上，立即进入下步反应

酶切消化

-在步骤 3.10.3 反应时，提前在冰上配制酶切消化反应液

image.png

• 用移液器吸取 4 μL 配制好的酶切消化反应液加入步骤4.3.4的 PCR 管中，涡旋震荡 3 次，每次3 s，瞬时离心将反应液收集至管底。
• 将 PCR 管置于 PCR 仪上，按照下表的条件进行反应：1）热盖，On；2）37℃，30 min；3）4℃，hold

酶切消化产物纯化

• 吸取 170 μL DNA Clean Beads 至酶切消化产物中，充分混匀。
• 加入 500 μL 的80%乙醇洗涤两次
• 加入32μl的TE buffer洗脱，取30 μl。

酶切消化产物质检

使用 Qubit® ssDNA Assay Kit 荧光定量试剂盒，按照定量试剂盒的操作说明对酶切消化纯化后产物进行定量。最终要求酶切消化产物产量（ssDNA）/ PCR 投入量（dsDNA）≥7%。例如：主带 300 bp 的打断产物，PCR 产物主片段大小为 384 bp，投入 250 ng 进行环化，其酶切消化产物产量应不少于 17.5 ng。

文库定量

-初始文库 DNA 浓度≥ 2fmol/µL，文库需用 Qubit® ssDNA HS Assay Kit 和 Qubit® Fluorometer定量，根据定量的结果计算投入量。
-注：投入体积 V（μL）=N×330 g/mol×40 fmol/(1000×1000×C)
-N 表示核苷酸数目（文库总片段长度），C 表文库浓度ng/μL

DNB 制备

• DNB 制备试剂准备
  取出 TE 缓冲液、App-A DNB 制备缓冲液、DNB 聚合酶混合液 I、DNB 聚合酶混合液 II（LC）和 DNB 终止缓冲液，置于冰盒上，待融化后用漩涡振荡器震荡混匀 5 秒后，短暂离心置于冰盒上备用。
  注意：不要将 DNB 聚合酶混合液 II（LC）室温解冻，不要用手长时间触碰管壁！

• DNB 制备
  1）DNB 制备体系1

  
  
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  2）DNB反应条件1

  
  
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  3）DNB 制备体系2
  
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  4）DNB反应条件2
  
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  当温度达到 4℃后立即取出 PCR 管，置于冰盒上，即刻加入 20µL DNB 终止缓冲液，用移液器和阔口吸头缓慢地吹打混匀，切勿震荡及剧烈吹打，置于4℃保存备用。注意：混匀 DNB 时一定要用阔口吸头缓慢吹打。

• DNB 浓度测定
  取 2μL 步骤2.2.5 产物，用 Qubit® ssDNA Assay Kit 和 Qubit® 荧光计，参照厂家说明书进行浓度测定。以 DNB 浓度≥8 ng/μL 为合格标准，对浓度低于 8 ng/μL 的 DNB需重新制备，对浓度高于40 ng/μL 的 DNB 需用 DNB 加载缓冲液 I 稀释到20 ng/μL。DNB 放置在4℃保存备用。

测序

测序平台

• 基因测序仪分类

  
  
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• MGISEQ 2000

  
  
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• MGISEQ T7

  
  
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