以碧云天C3601（细胞线粒体分离试剂盒）和MCE HY-K1060（Mitochondria Isolation Kit for Cultured Cells ）为例，讲解细胞线粒体分离的步骤。
1.准备溶液：室温解冻试剂盒中的各试剂，溶解后立即置于冰上并混匀。第一次使用时，将1.5 ml PMSF的溶剂加入到PMSF晶体中，溶解混匀，即为配制好的100 mM PMSF溶液，分装后置于-20℃保存。根据需要取适量线粒体分离试剂和线粒体裂解液备用。
2.收集细胞：
对于贴壁细胞：用PBS洗一遍，用胰酶消化细胞，100-200 g，4℃离心5 min收集细胞。
3.洗涤细胞：用冰冷的PBS轻轻重悬细胞沉淀，取少量用于计数。剩余细胞600 g，4℃离心5 min收集细胞沉淀。
4.细胞裂解：每2-5×107个细胞中加入1-2.5 ml线粒体分离试剂（临用前数分钟内加入PMSF，使其终浓度为1 mM，防止水解），轻轻悬浮细胞，冰浴放置10-15 min。（此步骤的作用应该就是裂解细胞质膜）
注：PMSF是一种常用的蛋白酶抑制剂，可抑制丝氨酸蛋白酶，半胱氨酸蛋白酶和乙酰胆碱酯酶，能够防止蛋白质的降解，保持其稳定性。
5.匀浆：将细胞悬液转移至一适当大小的玻璃匀浆器中，在冰上匀浆10-30下左右。
注：让玻璃管与柱塞之间微小的缝隙和细微的凹凸咬合，将柱塞转动时，产生碾切作用，使细胞轻易碾碎，而使线粒体等细胞器释放出来。
6.匀浆效果的鉴定：不同细胞的匀浆次数不同，需优化。通常可在匀浆10次后取2微升细胞匀浆，加30-50微升台盼蓝染色液，混匀后在显微镜下观察阳性（蓝色）细胞的数量，如果阳性细胞不足50%，可增加5次匀浆，当阳性比例超过50%可停止匀浆进入下一步。然而过度匀浆会导致线粒体的机械受损。
7.将细胞匀浆在600 g，4℃离心10 min。
注：此步离心目的在于去除细胞核、细胞碎片及未裂解细胞。将离心速度提
升至 1,000 g 可获得更纯的线粒体，但线粒体抽提率相对下降。
8.将上清转移至干净的离心管，11,000 g，4ºC 离心 10 分钟。
注：此步离心目的在于沉淀线粒体。将离心速度改为 3,500 g 可获得更纯的
线粒体，但线粒体抽提率相对下降。
9.弃去上清，所得沉淀即为细胞线粒体。
注：此步骤也可用于获得不含线粒体的细胞浆蛋白。收集本步骤中的上清，
12,000 g，4ºC 离心 10 分钟，获得的上清液即为不含线粒体的细胞浆蛋白。
后续可用 BCA 法或 Bradford 法测定蛋白浓度。
10.线粒体的应用
a. 完整线粒体的功能及酶活研究：每 2-5×10 7 个细胞分离得到的线粒体中
加入 150-200 μL Mitochondria Storage Buffer，重悬备用。后续可使用
MCE 线粒体膜电位检测试剂盒（Cat. No.: HY-K0601）测定分离得到的线粒
体的膜电位。
b. 线粒体蛋白分析：每 2-5×10 7 个细胞分离得到的线粒体中加入
临用前添加了 PMSF 的 Mitochondria Lysis Buffer（PMSF 终浓度为
裂解后得到的的线粒体蛋白可用于 SDS-PAGE、WB、IP 及酶活测定，也可用
BCA 法或 Bradford 法测定蛋白浓度
细胞线粒体分离（差速离心法）
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