varscan2 是我见过最好懂的找突变软件，官网的基本原理写的十分清晰，软件参数也很好懂，对我这种菜鸟选手十分友好。

简单使用

java -jar  VarScan.v2.3.9.jar somatic  normal_pileup  tumor_pileup  output
#会生成output.snp  output.indel两个文件，分布存储snp和indel

#如果要指定两个输出文件位置，不按照默认命名
java -jar  VarScan.v2.3.9.jar somatic  normal_pileup  tumor_pileup --output-snp  snp_file  --output-indel indel_file

具体流程

varscan呼叫体细胞突变过程中，是先分别对turm和norm样本，运行germline consensus calling，然后对两结果进行比较，因此首先得了解下germline consensus calling的流程

image.png

germline consensus calling中

一次解析一个碱基的堆积输入，统计最低映射质量（mapping quality）为1（此参数2.39版本已移除）的所有reads中，最低基本质量为（--min-avg-qual）的所有碱基。统计的合格碱基数大于等于（--min-coverage）时，VarScan 将检查观察到的每个等位基因，查看它是否：
满足最少数量的reads支持 [--min-reads2]
满足最小等位基因频率阈值 [--min-var-freq]
传递一个基本的链偏置过滤器（如果 --strand-filter 1）
费雪精确检验 p 值低于阈值（如果指定了 --p-value）
变异体被报告为杂合子，除非变异等位基因频率超过[--min-freq-for-hom]

相关参数
    --min-coverage  Minimum read depth at a position to make a call [8]
    --min-reads2    Minimum supporting reads at a position to call variants [2]
    --min-avg-qual  Minimum base quality at a position to count a read [15]
    --min-var-freq  Minimum variant allele frequency threshold [0.01]
    --min-freq-for-hom  Minimum frequency to call homozygote [0.75]
    --p-value   Default p-value threshold for calling variants [99e-02]
    --strand-filter Ignore variants with >90% support on one strand [1]
    --output-vcf    If set to 1, outputs in VCF format
    --vcf-sample-list   For VCF output, a list of sample names in order, one per line
    --variants  Report only variant (SNP/indel) positions [0]

再来看varscan的somatic参数

相关参数：
    --output-snp - Output file for SNP calls [output.snp]
    --output-indel - Output file for indel calls [output.indel]
    --min-coverage - Minimum coverage in normal and tumor to call variant [8]
    --min-coverage-normal - Minimum coverage in normal to call somatic [8]
    --min-coverage-tumor - Minimum coverage in tumor to call somatic [6]
    --min-var-freq - Minimum variant frequency to call a heterozygote [0.10]
    --min-freq-for-hom  Minimum frequency to call homozygote [0.75]
    --normal-purity - Estimated purity (non-tumor content) of normal sample [1.00]
    --tumor-purity - Estimated purity (tumor content) of tumor sample [1.00]
    --p-value - P-value threshold to call a heterozygote [0.99]
    --somatic-p-value - P-value threshold to call a somatic site [0.05]
    --strand-filter - If set to 1, removes variants with >90% strand bias [0]
    --validation - If set to 1, outputs all compared positions even if non-variant
    --output-vcf - If set to 1, output VCF instead of VarScan native format

实际上比起germline consensus calling的参数，只是多了一个--somatic-p-value，作为肿瘤样本与普通样本之间视作差异显著的阈值。再回头看varscan的somatic流程，就很好理解。

再简单说说Fisher's 精确检验

假设norm样本与tum样本，在某位点不存在有显著区别，给定数据集

计算公式为

一些贴士与胡思乱想

varscan需要配合samtools使用，先用samtool做堆积文件，或者用官网的bash -c 整文件流， samtool一些参数可见samtools mpileup使用
varscan 官网建议使用 -B disable BAQ (per-Base Alignment Quality)