RNA m6A修饰无疑是表观转录组学中最受关注的研究内容之一，目前的研究已经表明，m6A可能影响mRNA的运输、降解、翻译以及代谢等方方面面，这种转录后修饰参与多种病理生理过程。mRNA m6A研究该注意哪些问题？高通量测序获得的差异甲基化分子该如何挑选？下游分子实验该如何设计？纽科生物长期关注并参与RNA m6A修饰的课题，我们精心筛选并整理了有关m6A研究的常见问题，结合近期发表的m6A文献综述，给各位老师提供全面答疑。
参考文章封面：
mRNA m6A修饰的位点序列、分布特征：
1）什么样的序列会发生m6A修饰（序列偏好性）？m6A甲基化修饰主要受METT3/METTL14酶调控，修饰特征序列为DRACH（D:A\G\U，R=A\G，H=A\C\U），但是注意，并不是所有符合该序列规则的序列都能被甲基化，仅有小部分含有DRACH motif序列的片段能发生m6A修饰。目前文章中通常使用motif分析（图1）进行序列富集的结果展示。
2）修饰通常发生在什么区域，UTR还是CDS区（区域偏好性）？研究显示m6A目前主要发生在终止密码子附近和基因内部较长的外显子中（图2），根据数据表明，基因内部外显子中长度超过200nt的个数占所有内部外显子个数的15%，但是这些外显子中有近80%有m6A修饰位点，出现这个现象的原因并不是因为这些较长的内部外显子存在大量的motif，事实上这些外显子只含有30%左右的motif序列。临近可变多聚腺苷酸化（APA）m6A事件要多于远端APA位点。 METTL3/METTL14调控的m6A修饰系统并不仅仅受限于DRACH序列，还有更复杂的调控机制共同决定m6A修饰的发生位置。
3）什么因素决定m6A的位置选择（调控过程）？内部、外部因素共同决定调控m6A修饰位点选择与过程，m6A调控蛋白（Writer, Eraser和Reader）和靶基因作为一个系统，内部和外部是针对该系统进行定义，实际上m6A如何发生以及怎样发生通常是受很多因素共同调控的，内部因素包括特定序列与METTL3/METTl14的结合偏好性，外部因素主要依赖于转录因子，RNA结合蛋白（例如TARBP2），RNA聚合酶，H3K36me3组蛋白修饰可以募集METTL3/METTL14到mRNA并催化发生m6A修饰，当然FTO和ALKBH5也能在METTL3/METTL14之后在对m6A修饰水平进行改变。但是在这样一个复杂的系统中，多种因素如何共同决定m6A位点选择的疑问仍然没有被完全解答。
图3：m6A修饰的调控系统
（https://www.embopress.org/doi/full/10.15252/embj.2020105977）
4）既然有内外部因素共同决定，哪个占主导？如果外部因素占主导，那么理论上m6A修饰会成为一个高度动态的过程，细胞状态改变，多种外部调控因素也会改变，m6A水平理应对不同状态下包括RBP在内的这些外部因素会有动态应答；如果内部因素占主导，那么甲基化酶的改变会影响整体m6A的修饰，但不同位点m6A水平变化是相对有限的；也有可能内、外部调控机制交织在一起，共同调控m6A修饰的位置、区域和水平，该问题还需要进一步研究。
5）除了m6A本身变化以外，有其他重要因素影响m6A调控吗？有，那就是RNA m6A阅读蛋白，也就是通常说的Reader蛋白，Reader蛋白也会竞争性的结合m6A位点，且Reader蛋白本身的结合水平和表达水平都会对m6A修饰基因产生影响，这就是为什么有时我们看到当m6A水平并没有发生改变时，不同比例、水平的Reader蛋白也会造成被修饰基因发生改变的主要原因，当然发生在Reader蛋白上的翻译后修饰也能对Reader蛋白自身的酶活、细胞定位以及结合亲和性产生影响，所有这些综合起来共同对mRNA m6A进行调控（图4）。
图4：YTH家族蛋白参与mRNA的代谢、翻译和降解（https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33928028/#&gid=article-figures&pid=figure-1-uid-0）
6）修饰的特异性的作用：这种修饰特异性带来的最直接影响是m6A介导的基因选择性表达，一旦m6A集中在特定部分转录本群体时，m6A 阅读蛋白的调控系统就会发挥重要功能。在研究示例中，小鼠胚胎干细胞mESCs中80%能调控多能性的基因都受到m6A修饰，这种修饰促进这些转录本的清除，从而让细胞状态由多能性转向胚胎干细胞分化。不同位置的m6A修饰也有可能影响表达，m6A介导的调控效果依据位置的不同而不同。
图5：Mettl3 KO ESCs resist termination of naïve pluripotency
（m6A mRNA methylation facilitates resolution of naïve pluripotency toward differentiation）
7）m6A mRNA的作用是什么？m6A修饰影响mRNA的降解和翻译是目前主要观点。YTHDF家族蛋白（包括YTHDF1、YTHDF、YTHDF）在内的m6A阅读蛋白调控m6A靶分子降解和翻译。最早研究的YTHDF2可以通过多种途径造成m6A mRNA发生降解，比如募集CCR4-NOT复合物或者RNase P/MRP复合物至m6A mRNA使其发生降解；YTHDF1、YTHDF3调控靶mRNA的翻译，YTHDF1募集eIF3蛋白，YTHDF3协同YTHDF1共同影响靶mRNA的翻译，当然IGF2BP1、IGFBP2和IGFBP3也会结合m6A修饰转录本并增强其稳定性（图4）。
8）如果进行高通量测序之后，靶点的挑选和下游实验该如何进行？通过上述解答不难看出，对于m6A修饰通常是基因、位点、区域、功能特异的，因此如果在进行高通量测序之后选择靶点时，首先应当考虑靶分子的功能，该分子应当同所研究的疾病和生物学过程具有紧密的联系（如在肝癌中选择SOCS2），其次应当考虑该位点相关测序参数，如甲基化倍数改变（fold change）和该分子的表达倍数改变，从上述问题可以明确看到不同的调控机制给靶基因带来不同的影响，因此要重点关注转录本甲基化水平改变的同时也要关注表达改变，此外还可以结合现有数据库进行分析，从上述问题中可以发现部分RBP和转录因子本身对m6A修饰也会产生影响，参考其他RBP相关数据库（POSTAR、RMBase等）可以综合考虑是否在下游实验设计当中嵌入其他分子（尤其是Reader蛋白），综合以上信息进行挑选靶点对下游的研究故事完整性有很大帮助。
RNA m6A修饰仍然是当下最火的科研热点之一，有关RNA m6A的相关研究还在继续，我们将在接下来的推送中为大家解决更多具有代表性的科研问题，请各位老师持续关注。
