文章题目：Small RNA deep sequencing reveals the expressions of microRNAs in ovine mammary gland development at peaklactation and during the non-lactating period
发表期刊：Genomics
技术手段：Small RNA测序
派森诺生物与甘肃农业大学携手合作，于近期在《Genomics》上发表了Small RNA深度测序揭示绵羊泌乳高峰期和空杯期乳腺发育中的microRNA表达相关研究成果。
研究背景
小尾寒羊是一种广泛分布于我国北方和中部地区的高繁殖力绵羊品种，平均产羔率为280％。然而，小尾寒羊的低成活率已成为限制农民商业收益的重要因素之一。研究表明，母羊的产奶量会通过影响羔羊的发育和生长速度而影响羔羊成活率。因此，阐明小尾寒羊的乳腺发育和泌乳分子机制具有重要经济作用。
MicroRNA（miRNA）是一类长度约20-24个核苷酸的非编码小RNA分子。在动物中，通过与其靶基因的3'-UTR 结合而影响目标mRNA的稳定性及翻译，最终在转录后水平上负调节基因表达。研究表明，miRNA是影响乳腺发育、泌乳及其与乳房相关疾病的关键调控因子。迄今为止，miRNA在家畜乳腺组织中表达的研究主要集中在奶牛、山羊、水牛和猪中，而在绵羊中研究很少。
因此，在本研究中，使用小RNA测序技术研究了泌乳高峰期和空杯期的小尾寒羊乳腺组织中miRNA表达谱，确定了一些差异表达miRNA及其与乳腺发育和泌乳相关的靶基因和KEGG途径，使我们对miRNA在绵羊乳腺中的作用有了更深层次的了解。
研究方法
样本：泌乳高峰期的小尾寒羊乳腺组织、空杯期的小尾寒羊乳腺组织
实验方法：Small RNA测序
测序平台：illumina Hiseq
技术路线图见下
研究结果
1、小RNA测序数据汇总
对来自泌乳高峰期和空杯期的小尾寒羊乳腺组织的6个样品进行小RNA测序。数据质量合格后，对数据进行小RNA序列的长度和丰度统计，结果如图1所示：泌乳高峰期和空杯期的小尾寒羊乳腺组织中的小RNA长度分布是相似的。大多数小RNA的长度分布在18-24 nt的范围内，其中长度为22 nt的MicroRNA（miRNA）最多，分别在泌乳高峰期和空杯期绵羊乳腺组织中占34.28％和27.00％。其次是长度为21 nt（泌乳高峰期绵羊乳腺组织中占8.44％，空杯期绵羊乳腺组织中占13.25％）和23 nt长度（泌乳高峰绵羊乳腺组织中占8.43％，空杯期绵羊乳腺组织中占9.63％）的miRNA。
图1 小尾寒羊泌乳高峰期和空杯期乳腺组织中小RNA的长度分布及丰度
2、已知和新的miRNA的鉴定
通过与数据库比对和预测，对小RNA进行分类注释，注释结果如图2所示：以miRNA数量最多（包括已知的miRNA和新的miRNA），分别在泌乳高峰期和空杯期绵羊乳腺组织中占89.90％和88.04％。
图2 小RNA在绵羊乳腺中的分布
（a）泌乳高峰期绵羊峰乳腺中的小RNA类型 （b）空杯期绵羊乳腺中的小RNA类型
接下来分析已知miRNAs的表达水平，空杯期的绵羊乳腺组织以miR-143，miR-21，miR-26a，miR-99a，miR-148a，let-7i，let-7g和let-7f的丰度最高（图3）。然而，在泌乳高峰期绵羊乳腺组织中丰度最高的是miRNA是miR-148a，miR-143，miR-26a，let-7f，let-7g，miR-30a-5p，let-7a和miR-21（图3）。
图3 空杯期绵羊乳腺组织（a）和泌乳高峰期绵羊乳腺组织（b）中鉴定出的八个表达最高的miRNA
3、泌乳高峰期和空杯期绵羊乳腺组织间的差异表达miRNA
对已知miRNA进行差异表达分析，结果显示（表1）：在泌乳高峰期和空杯期绵羊乳腺组织中共鉴定出23条差异表达的miRNA。相对于泌乳高峰期的绵羊乳腺组织，有八种miRNA在空杯期绵羊乳腺组织中表现出更高的表达量，其中差异表达上调最高的是miR-199a-3p，其次是miR-221、miR-125b、miR-329b-3p和miR-493-5p。相对于泌乳高峰期的绵羊乳腺组织，有15种miRNA在空杯期绵羊乳腺组织中表现出更低的表达水平。其中差异表达下调最低的是miR-148a，其次是miR-30a-5p、miR-200c、miR-200a和miR-200b。
表1泌乳高峰期和空杯期绵羊乳腺组织间的差异表达miRNA
4、差异表达miRNA的靶基因预测和KEGG通路分析
采用miRanda和TargetScan预测了差异表达miRNA的靶基因，总共鉴定出13082个靶基因。选择差异表达miRNA中表达最显著的十个miRNA（非泌乳期绵羊乳腺组织中上调和下调表达最显著的miRNA各五个）以及相应的靶mRNA构建miRNA-mRNA网络（图4）。
图4 差异表达miRNA的miRNA-mRNA网络及其靶基因
注：红色代表在空杯期中上调的miRNA，绿色箭头代表在空杯期中下调的miRNA（相对于泌乳高峰期乳腺组织）；灰色圆圈代表预测的miRNA的靶基因
基于KEGG数据库，对差异表达miRNA的靶基因进行KEGG富集分析。分析结果显示：在空杯期中上调表达的差异miRNA的靶基因涉及24条代谢通路。图5展示了富集程度最显著的前十五条代谢途径。其中富集程度最高的是溶酶体通路，招募了18个靶基因。其次是Wnt信号通路、 MAPK信号通路、GPI-锚定蛋白生物合成通路、内质网中的蛋白质加工通路和FoxO信号通路，分别招募了16、21、7、17和14个靶基因。
对于在空杯期中下调表达的差异miRNA，其靶基因富集于21条代谢途径上。其中富集最显著的途径是PI3K-Akt信号通路 ，招募了33个靶基因。其次是内质网中的蛋白质加工通路、轴突引导通路，血小板活化通路、肌动蛋白细胞骨架调控通路和溶酶体通路，分别招募的靶基因数量为22、22、18、21和18个（图5）。
图5泌乳高峰期和空杯期绵羊差异表达miRNA的靶基因KEGG富集分析
（a）与高峰期相比，在空杯期绵羊乳腺组织中差异上调miRNA的靶基因KEGG富集分析
（b）与高峰期相比，在空杯期绵羊乳腺组织中差异下调miRNA的靶基因KEGG富集分析
注：x轴表示-log10（p-value），x轴表示该途径中募集的差异表达miRNA的靶基因数目
5、RT-qPCR验证差异表达miRNA
选择十六个差异表达的miRNA，通过RT-qPCR验证miRNA测序结果的可靠性。分析结果如图6所示：miR-200b、miR-103、miR-107、miR-148a、miR-30b、miR-30d、miR-200a、let-7b、miR-30a-3p和miR-30a-5p在空杯期绵羊乳腺组织中的表达比在泌乳高峰期中低。然而，miR-125b、miR-493-5p、miR-432、miR-199a-3p、miR-221和miR-329b-3p在空杯期绵羊乳腺组织中的表达比在泌乳高峰期中高。RT-qPCR结果表明，差异表达miRNA的表达趋势与miRNA测序结果相一致，证实了miRNA测序方法的可靠性和可重复性（结合结果3看）。
图6 RT-qPCR验证16个差异表达miRNA
注：数据显示三个重复的平均值±SD；误差棒为标准偏差
总 结
这项研究通过对泌乳高峰期和空杯期的小尾寒羊乳腺组织进行小RNA测序，研究miRNA在这两个泌乳时期中miRNA表达情况。筛选到了一些差异表达的miRNA，及其与乳腺发育和泌乳相关的靶基因和重要的KEGG途径(溶酶体通路、Wnt信号通路、 MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路等)。使人们对miRNA在绵羊乳腺中的作用有了更进一步的了解。
