影响因子：6.0

研究概述：在癌症免疫治疗领域，具有安全性和功能特性的基于mRNA的疫苗正蓬勃发展。然而，肺腺癌 （LUAD） 的稳定免疫分子亚型和 LUAD mRNA 疫苗开发的新型肿瘤抗原仍然难以阐述清楚。因此，迫切需要一种新的方法来识别合适的LUAD亚型和潜在的肿瘤抗原。在这项研究中，作者利用7种机器学习 （ML） 算法通过对单细胞和组织转录组数据开发了LIMOC系统，包括三种亚型：LIMOC1、LIMOC2和LIMOC3。并在LUAD中鉴定了CHIT1、LILRA4和MEP1A作为新的肿瘤抗原。这些基因表达量上调，与APC浸润呈正相关，有望成为mRNA疫苗的候选者。另外，LIMOC2亚型预后最差，适用于以上述三个基因为靶点的mRNA疫苗治疗。其中，索拉非尼和阿扎胞苷具有作为亚型特异性治疗药物的潜力。这些发现有可能为mRNA疫苗的开发奠定基础，并为肿瘤的精确治疗提供新的思路。

LIMOC系统的构建和免疫亚型的鉴定

免疫亚型可能会影响免疫治疗的有效性，并为患者选择mRNA疫苗接种提供指导。为了识别这些亚型，作者采用七种机器学习算法来构建LIMOC系统。该分析得到三种共识亚型，分别为 LIMOC1、LIMOC2 和 LIMOC3（如图1A）。图2B展示了在LUAD中显示获得的多组学数据。作者研究了患者生存期与LUAD亚型之间的关联。与 LIMOC1 和 LIMOC3 患者相比，LIMOC2 患者的中位 OS 明显更短（如图1C）。接下来，作者基于亚型特定基因，使用NTP将Meta队列和GSE72094队列中的样本分为LIMOC组，两个队列中都观察到类似的结果（如图1D-E），所有的LIMOC2患者表现出较差的临床结果。作者还对此分类与先前研究团队的分子分类之间的关联进行了研究（如图1F-K）。上述研究方法都显示出与患者预后的相关性，所有预后差的亚型都集中于LIMOC2中，这表明作者分类方法的可靠性。例如，在Song等人的研究中，大多数 LIMOC2 患者属于预后最差的C3 组，这与作者的发现一致，即 LIMOC2 患者的预后最差（如图1G）。在We等人的研究中也发现了类似的结果（图1H-K）。

突变状态与免疫亚型的关系

三种亚型与免疫治疗疗效相关，所以作者对三种亚型的肿瘤突变负荷（TMB）进行了评估。LIMOC2 的 TMB 明显更高（图1L-M），并携带更多与APOBEC特征相关的突变。LIMOC2在TP53、NLRP3、TLR4和RB1等频繁改变的基因中突变最多。除此之外， LIMOC2 的染色体不稳定性更高，表现为拷贝数改变 （CNA） 的显着增加（图1O），在LIMOC2中，拷贝数增益主要位于8q24.21区域，在其他亚型中未扩增。相反，已知在细胞永生化过程中，易失活的Ch9p21.3区域在LIMOC2亚型中主要变现为特异性缺失。

LUAD免疫亚型与调节子分析的相关性

转录组调控网络在肿瘤的发生和增殖中起着关键作用。因此，作者评估了 68 个染色质重塑调节子和 23 个其他调节子的活性，以确定亚型之间的潜在差异。结果揭示了三种亚型的不同调控模式。LIMOC2患者与 Fox 基因家族相关，而 LIMOC3患者可能受雄激素受体（AR）和雌激素受体2（ESR2） 激活的影响（图2A）。作者进一步构建了十种致癌途径的特征，并使用GSVA方法计算了富集分数。该分析显示，在LIMOC2患者中，细胞周期和PI3K致癌途径被激活（图2B-C）。同样，作者通过Meta队列和GSE72094对列的分析发现，LIMOC2亚型与NRF2致癌途径的激活相关，这表明LUAD的低免疫浸润可能是由致癌途径功能障碍所致。另外，LIMOC3具有较高的TGF-β和基质成分得分，表明LIMOC3表型既具有免疫“热”特征，又具有免疫抑制特征，这可能会阻碍主动免疫反应。

对不同代谢途径激活的分析显示出不同亚型之间的独特模式（图2D）。LIMOC1与精氨酸生物合成、抗坏血酸和糖醛酸代谢以及丙酮酸代谢途径的激活相关。相反，LIMOC2与嘧啶代谢、嘧啶生物合成和维生素B6代谢的激活相关。最后，LIMOC3患者亚油酸代谢和花生四烯酸代谢途径均显示激活状态。这些发现表明这三种亚型展现出独特的代谢模式，可以作为独特的分子特征和临床结果，有助于患者不同亚型的识别。

LUAD亚型与临床特征、细胞特征和分子特征的相关性

作者研究了每种LUAD亚型与的临床特征，包括年龄、性别和肿瘤分期之间的相关性。研究结果表明，LIMOC2 亚型的患者主要为老年男性，总生存期明显较短。接下来，作者通过ssGSEA 算法评估了 TCGA队列、Meta-队列 和GSE72094队列中免疫细胞浸润水平变化（如图3A-C）。LIMOC2 患者的活化记忆 CD4 T 细胞浸润水平高，而 LIMOC3患者的 CD8 T 细胞、CD4 幼稚 T 细胞、巨噬细胞、Tregs、单核细胞、中性粒细胞和其他免疫细胞浸润水平高。与其他亚型相比，LIMOC3 亚型的 M2 巨噬细胞、中性粒细胞和 Tregs 的浸润水平尤其高。免疫检查点（ICPs）是一种可以阻止免疫系统识别和攻击癌细胞的机制。作者发现，与其他亚型相比，LIMOC3 亚型 ICP 的基因表达量更高（图3E、H 和 K）。鉴于免疫原性细胞死亡（ICD）调节剂在刺激抗肿瘤免疫中的关键作用，作者探索了这些调节剂在三种LIMOC亚型中的表达水平。作者分析了三个队列中的 21 个 ICD 调节剂，发现超过一半的 LIMOC2 显着上调，包括 ANXA1、CALR、CXCL10、EIF2A、EIF2AK1、EIF2AK2、HMGB1 和 PANX1 （如图3F、I 和 L）。

单细胞水平上三种亚型的分子特征

为了更深入地了解LUAD中的LIMOC系统，作者分析了一个单细胞RNA测序数据集（GSE131907）。该数据集来源于 41 个样本，包括 27,578 个转录本和 191,736 个细胞数据。将数据进行预处理之后，为了更好地表征细胞组成，作者量化了细胞类型的比例（如图4A）。其中，免疫细胞群最多，其次是上皮细胞（如图4B）。作者从中分离出18,913个恶性细胞，根据每个恶性细胞中分类生物标志物的归一化表达，将 NTP 用于 LUAD 亚型。其中将6891个细胞归类为LIMOC1，将6085 和 5937 个细胞分别归类为LIMOC2 和 LIMOC3。作者还通过t-SNE揭示了恶性细胞的不同簇，反映了它们的亚型和样本来源（如图4C-E）。LIMOC1肿瘤细胞主要富集于mBrain中，LIMOC2肿瘤细胞主要富集于tL/B中，LIMOC3肿瘤细胞富集于mLN中。这些发现也表明侵袭性肿瘤内肿瘤异质性更大（如图4F）。

接下来，作者对十个致癌通路进行了GSVA分析以计算富集分数。与先前的结果一致，在LIMO2亚型中细胞周期被激活，而TGF-β通路在LIMOC1和LIMOC3中被激活（图4G）。同时，恶性细胞中三个亚型的代谢模式也与上述结果趋势一致（图4H）。作者还对ICP和ICD调节因子的表达水平进行了探索。正如预期的那样，LIMOC3中ICP均高表达，而近一半的ICD调节因子在LIMOC2中上调，包括CXCL10、EIF2AK2、HMGB1和ANXA1。这些发现进一步证实了先前结果的可靠性（如图4I-J）。

LUAD中新型候选抗原筛选

为了筛选出LUAD中新型的肿瘤抗原。首先，作者通过整合TCGA和GTEx数据，确定了潜在编码肿瘤抗原的1897个上调基因，调控基因的染色体分布（如图5A）。其次，识别了12501个突变基因，其中前20个基因显示在图5B中。最后，基于CNV数据选择了15063个扩增基因，其中前10个扩增基因显示在图5C中。作者在结合表达、突变和拷贝数数据后，共获得935个高表达、突变和扩增基因作为有前景的候选肿瘤抗原。在TCGA数据集中，识别了3088个与OS相关的基因作为mRNA疫苗靶标的关键基因。此外，作者考虑到APC在免疫中的作用，还探究了基因表达和APC丰度之间的关系，共得到987个与APC水平强相关的基因。最后，通过交叉分析所有三个数据集（表达、突变/扩增、和APC相关性），确定了三个LUAD候选肿瘤抗原：CHIT1、LILRA4和MEP1A（如图5D）。这三个候选肿瘤抗原与LUAD患者OS和PFS显著相关（如图5E-J）。这表明这些基因在LUAD的发展和进展中发挥着至关重要的作用。作者在含有人类LUAD组织的组织微阵列（TMAs）上进行了免疫组化，以确定上述候选抗原在蛋白水平上的变化。与先前的结果一致，与癌旁组织相比，CHIT1、LILRA4和MEP1A在LUAD组织中的表达均显著上调（图5K-P）。此外，还进行了siRNA转染实验，发现CHIT1、LILRA4和MEP1A的沉默抑制了LUAD细胞系A549的增殖，且这种抑制效果是时间依赖的（图5Q）。上述研究结果表明，CHIT1、LILRA4和MEP1A在LUAD中上调，并且与基因突变、扩增和APC浸润相关。这表明，针对这三个基因的mRNA疫苗可能会诱导抗肿瘤免疫反应并消灭癌细胞。

LIMOC2亚型中APC标记物与这三个抗原之间的相关性

综合上述所有结果发现， LIMOC2 亚型的患者可能更适用于以 CHIT1、LILRA4 和 MEP1A 为靶点的 mRNA 疫苗。为了进一步研究，作者对APC 标记物和 LIMOC2 亚型内的三种候选抗原之间的mRNA表达量进行了相关性分析。研究结果表明，CHIT1与LILRA4 与 CD40、CD80和CD86呈正相关。在Meta队列和GSE72094队列中也观察到了相同的结果（如图6A-B，D-E，G-H）。然而，MEP1A 与CD40、CD80和CD86在三种队列中并不是全部相关。综上所述，在LIMOC2 亚型患者中，这三个抗原，尤其是CHIT1与LILRA4，和APC 标记物显著相关（如图6C，F，I）。

LUAD中三种肿瘤抗原的潜在生物学价值

为了阐明三种候选抗原（CHIT1、LILRA4 和 MEP1A）发挥作用的潜在机制，作者进行了相关通路富集分析。结果表明，CHIT1在免疫相关通路，包括“Th17细胞分化”、“趋化因子信号通路”和“细胞因子-细胞因子受体相互作用”（如图6J，M）中富集。LILRA4主要富集于“免疫效应过程的调节”、“细胞因子产生的正调控”和“T细胞活化”（如图6K，N）等生物学过程。MEP1A主要富集于“B细胞受体信号通路”和“细胞因子-细胞因子受体相互作用”（如图6L，O）等通路。这些结果表明，CHIT1、LILRA4和MEP1A与免疫生物学过程有关，为开发靶向这些基因的mRNA疫苗提供了基础。

亚型特异治疗药物的筛选和验证

鉴于LIMOC2亚型患者的预后差，所以探索亚型特异性治疗至关重要。在这项研究中，作者采用综合方法来识别适用于LIMOC2患者的潜在治疗药物（如图7A）。首先，作者从三个独立的药物反应数据集（CTRP、GDSC和PRISM）下载数据。并利用pRRophetic软件包中的calcPhenotype函数来估计每个LUAD患者对每种药物在每个数据集中的敏感性。最后，使用“limma”包对三个亚型之间的不同敏感性进行分析。这项分析确定了几种潜在的LIMOC2特异性药物：在CTRP中有136种、GDSC中有66种、PRISM中有269种（如图7B）。然后，作者选择至少在两个数据集中均被显著识别的药物作为LIMOC2特异性药物，最终筛选出28种潜在治疗候选药物（如图7C）。为了进一步缩小候选药物的范围，作者通过文献检索在治疗LUAD中有实验数据以及临床数据的化合物作为候选药物，以及在CMap 数据集中与 LUAD 中通常观察到的基因表达模式相反的化合物作为候选药物，最终鉴定索拉非尼和阿扎胞苷对LUAD具有潜在治疗效果（如图7D）。为了进一步验证索拉非尼和阿扎胞苷的治疗潜力，作者使用四种LUAD细胞系进行体外实验：NCI-H1395、NCI-H2347、HCC827和Calu-3。根据NTP预测结果，NCI-H1395和Calu-3分别归属于LIMOC1样亚型和LIMOC3样亚型，而HCC827和NCI-H2347则归类为LIMOC2样亚型。索拉非尼和阿扎胞苷的细胞活力测定结果与预测结果一致（如图7E-F），证明这两种化合物可能是治疗LIMOC2患者的潜在治疗药物。

研究总结：

这项研究将LUAD患者区分为不同的免疫亚型，并筛选出针对LUAD的mRNA疫苗肿瘤抗原。基于单细胞以及组织转录组数据，作者利用7种机器学习算法，将LUAD患者分为三种免疫亚型：LIMOC1、LIMOC2、LIMOC3。将 CHIT1、LILRA4 和 MEP1A 确定为针对 LUAD 的 mRNA 疫苗的新型肿瘤抗原。LIMOC2 亚型患者是一种独特的免疫亚型，与患者预后不良显著相关，适应于以CHIT1、LILRA4 和 MEP1A为靶点的mRNA免疫治疗。并且发现，索拉非尼和阿扎胞苷可以作为LIMOC2 亚型的潜在治疗药物。本研究为为LUAD的个性化治疗提供了宝贵的思路，并有望改善患者的治疗效果。