多色免疫组化（Multi-color IHC）简称多标，顾名思义在同一张切片上标记多个抗体，通过不同的颜色来共定位蛋白的表达。其原理仍然是利用了抗原抗体的特异性结合，与免疫组化和免疫荧光，甚至于western blot的原理异曲同工。常用的是用石蜡切片做多色免疫组化，这是因为石蜡包埋可以保持组织形态的完整，染色后的图片质量高。不用冰冻切片的目的是超低温形成的组织内冰晶容易损伤细胞结构，导致抗原弥散。虽然石蜡切片经过烘片和抗原修复对抗原有一定影响，但对于抗原性较好的蛋白，这一步的影响可以作为此要考虑的问题。

    我的课题与肝脏相关，所以做多标的样本自然是肝脏。对于肝脏冰冻切片的效果还有待实验验证，目前在做的是石蜡切片的多标，所以以此为出发点讲解一下“巴菲尔”公司的Opal多标染色方法。具体的实验原理即酪胺信号放大技术（TSA, Tyr Signal Amplification)。原理上简单来说，利用二抗后面偶联的HRP来催化后续加入体系的非活性荧光素(Opal 染料)。Opal染料的稀释液中带有过氧化氢，HRP和过氧化氢反应产生游离氧，结合opal染料，使其变成一种活性中间态。这种活性中间态能无差别结合蛋白上的酪氨酸残基，而后在特定波长的激发光下发出荧光。这里需要强调的是，中间态与Tyr残基的结合无差别，无论是一抗和二抗，还是信号蛋白，都能结合。当用Striping buffer剥抗体的时候，一抗（包括一抗）后面的所有结合物都被剥离，只剩下信号蛋白上结合发光基团。

TSA原理图*

    这种方式的好处是不需要考虑抗体的种属问题，只需要选择好用的一抗，二抗可以用同一种抗一抗的二抗。无论是配色，还是抗体的搭配都很简单。唯一让我觉得欠缺的一点就是试验周期长。比如，我需要染三色（包括DAPI），就需要三天时间，四色需要四天，七色需要七天。另外，一抗用于做多色免疫组化还需要不断摸索抗体的最佳浓度，所以周期会较长。不像免疫荧光，时间相对短很多。

多色染料光谱*

关于光谱，有激发光(Excitation)和出射光(Emission)，图中标出的是Emission。在说法上，与流式中的配色光谱有差别，流式中写的是激发光，而多色免疫组化中写的是出射光。

Ref：

*https://www.biomart.cn/48563/news/2904659.htm