本文来自浙江大学医学院附属邵逸夫医院的蔡秀军教授团队的一篇刊登在《Molecular Cancer》的文章（N6-methyladenosine-modified CircRNA-SORE sustains sorafenib resistance in hepatocellular carcinoma by regulating βcatenin signaling），影响因子15.302分，该文章阐述了在肝细胞癌中m6A修饰的CircRNA-SORE通过调节β-catenin信号通路维持索拉非尼耐药性。
肝细胞癌是最常见的癌症，也是在全球上死亡率最高的一种癌症之一，目前对肝癌的治疗主要应用手术切除癌变组织，但不适用于晚期肝癌患者。对于不能切除的肝癌，治疗方法主要是通过移植，消融，动脉化疗栓塞，靶向治疗和免疫治疗。索拉菲尼是一种多激酶抑制剂，是美国食品和药物管理局批准的治疗晚期肝癌的一线靶向药物。但由于肝癌的发生机制复杂，大多数患者在接受索拉菲尼治疗数月后会对其药物产生耐药性，使肝癌进一步恶化，给治疗带来了巨大的困难。
CircRNA最常见的作用机制是作为ceRNA，吸附各种miRNA，导致原本miRNA结合的mRNA的翻译不能被miRNA阻止，形成mRNA的竞争性激活，从而引起下游蛋白表达水平的升高而产生相对应的生理病理表现。目前，在肝细胞癌中，CircRNA对索拉非尼的原发性和获得性耐药性机制尚不清楚。
m6A修饰是真核mRNAs最普遍的内部修饰，其影响mRNA代谢的关键过程，包括mRNA定位、剪接、翻译和降解，进而调节重要的生物学过程。近年来研究者发现，circRNA的m6A修饰在肿瘤的进展中扮演着重要作用，能通过抑制肿瘤细胞分化和凋亡发挥着致癌作用。
结果
1、CircRNA-SORE在索拉菲尼耐药的肝癌细胞系中表达上升
本研究团队前期首先建立了四株索拉菲尼耐药的肝癌细胞系，通过生物信息学分析和分子手段找到了在耐药形成过程中扮演着重要角色的circRNA-SORE。通过UCSC Genome Browse网站分析发现，circRNA-SORE是由TLE4基因的第7位和第8位外显子后剪接产生的，作者也通过设计circRNA-SORE特异性引物，通过PCR产物跑电泳和产物结果测序，片段大小和序列都符合网站分析的结果。荧光原位杂交（FISH）发现circRNA-SORE定位在细胞质中。以上所知，作者确认了CircRNA-SORE是引起在肝癌患者中索拉菲尼耐药的重要分子。
2、CircRNA-SORE对维持索拉菲尼耐药至关重要
为了阐明CircRNA-SORE对维持索拉菲尼耐药起到重要的作用，本研究团队利用siRNA靶向敲低circRNA-SORE，来研究CircRNA-SORE对索拉菲尼在肝癌细胞耐药机制。结果表明敲低circRNA-SORE以及联合使用索拉菲尼药物，肝癌细胞凋亡显著提高。通过探索CircRNA-SORE对肝癌患者无复发生存时间（RFS）的影响，结果发现低表达的circRNA-SORE较高表达组具有更长的RFS时间。这些结果表明了：circRNA-SORE是维持索拉非尼耐药性的关键，而沉默circRNA-SORE通过诱导肿瘤细胞凋亡显著提高索拉非尼的疗效。
3、CircRNA-SORE作为ceRNA吸附miR-103a-2-5p和miR-660-3p作用
CircRNA最主要的作用机制是通过海绵吸附miRNA，导致miRNA不能阻止mRNA的翻译，形成mRNA的竞争性激活，进而引起下游蛋白表达水平的升高。本文作者基于相关circRNA和miRNA结合预测软件，筛选出12种与circRNA-SORE结合的miRNA分子，通过RNA-pulldown实验结果发现8种miRNA在circRNA-SORE上由有明显的富集。通过在耐药细胞中加入miR-103a-2-5p mimic和miR-660-3p mimic后发现，其耐药细胞对索拉菲尼的敏感性显著升高。通过FISH技术发现circRNA-SORE能与miR-103a-2-5p和miR-660-3p 在细胞中共定位。通过RNA免疫共沉淀和双荧光素酶实验进一步提示circRNA-SORE能与miR-103a-2-5p和miR-660-3p相结合。
接着作者想弄清楚circRNA通过结合miRNA后是通过哪些信号通路来调控索拉菲尼耐药的，作者发现，在肝癌的研究中，wnt/β-catenin信号通路起到关键的作用。通过实验结果发现，耐药细胞中β-catenin的蛋白水平显著高于野生细胞，其表达量与circRNA-SORE的表达水平呈正相关。进一步实验结果表明，耐药细胞中的β-catenin和上游wnt2b的蛋白表达水平均受到circRNA-SORE对miR-103a-5p和miR-660-3p调控影响，作者猜测circRNA-SORE有可能是通过wnt/β-catenin信号通路调控的这两个miRNA的下游。通过位点突变前后的双荧光素酶报告实验证实了这种假设。综上所述可知，circRNA-SORE海绵吸附miR-103a-5p和miR-660-3p作用后通过wnt /β-catenin途径来诱导索拉非尼耐药。
4、circRNA-SORE存在m6A修饰作用
近年来，越来越多的研究发现RNA的m6A甲基化修饰在肿瘤的发展中扮演着重要的作用，而circRNA的m6A修饰（常发生在RRm 6 ACH模体上，R = G or A; H = A, C or U）。作者猜想circRNA-SORE是否也存在m6A修饰作用，通过相关数据库预测，发现circRNA-SORE序列的juction位点附近存在一个极有可能被m6A修饰的位点。RNA pulldown实验表明circRNA-SORE能和m6A相关的酶蛋白酶结合（YTHDF1、YTHDF2、METTL3和FTO）。再通过甲基化RNA免疫共沉淀实验表明耐药细胞中circRNA-SORE的m6A修饰水平较野生细胞增高。最后通过对m6A甲基化相关蛋白进行沉默发现，对METTL3和METTL14敲减后，circRNA-SORE的m6A修饰水平显著下降，而对FTO敲减后，其修饰水平显著升高，说明了circRNA-SORE有m6A修饰位点的存在。
5、体内实验验证circRNA-SORE会引起索拉菲尼在肝癌耐药性
作者通过构建小鼠肝癌成瘤模型和对应的索拉菲尼耐药模型，实验结果表明，相比较对照组，过表达sh-circRNA-SORE组显著增加了肝癌细胞对索拉菲尼药物的敏感性；在肝癌成瘤模型实验中，结果也表明了过表达circRNA-SORE和联合用药后，能显著抑制在小鼠体内成瘤能力；作者最后做了免疫组化实验观察结果，发现过表达circRNA-SORE组中，Wnt2b 和 β-catenin的阳性率明显降低；在体内水平证实了circRNA-SORE可以通过wnt /β-catenin途径来诱导索拉非尼耐药。
综上所述，circRNA-SORE能海绵吸附miR-103a-2-5p和miR-660-3p，促使wnt /β-catenin途径来诱导索拉非尼耐药。其主要的是由m6A修饰的circRNA-SORE使在肝癌索拉非尼耐药形成过程中发挥了重要的作用。
