蜂鸟是最小的脊椎动物，他们的自然和进化历史、形态和生理特征有别于哺乳动物模型系统，如小鼠、大鼠和人类。蜂鸟采用悬停飞行，拥有所有鸟类中最高的振翅频率，并以此维持所有脊椎动物中最高的新陈代谢率。此外，红喉北蜂鸟（Archilochus colubris）每年都会从北美东部的繁殖地迁徙到中美洲南部的越冬地，是所有物种中空中迁徙距离最长的。因此，蜂鸟在飞行肌肉中氧化脂肪酸和碳水化合物为高能量脂质的速度比迄今研究的任何其他脊椎动物都快。值得注意的是，蜂鸟可以在短时间内从完全依赖内源性脂质氧化到完全依赖新摄入的糖类来为其悬停飞行提供燃料。因为即使蜂鸟在觅食时可以将摄入的花蜜直接氧化为飞行燃料，在其夜间或长途迁徙飞行时，它们不得不转而氧化储存在体内的脂肪，这些脂肪来自摄入的糖。但由于缺乏相关酶在序列、表达和调控方面的差异性信息，因此无法了解该生物如何调节能量转换。
近日，美国约翰霍普金斯大学Winston Timp教授研究团队在Genome Research期刊上发表题为“Genomic insights into metabolic flux in hummingbirds”的研究型文章。该文章利用长短reads测序相结合的方法对红喉北蜂鸟的基因组进行了染色体水平的组装。此外，该研究还对禁食和进食代谢状态下的蜂鸟肝脏和肌肉组织使用混合长短reads的RNA测序，并进行了全面的转录组组装和注释。最后，基于基因组和转录组的数据揭示了红喉北蜂鸟代谢快的分子机制。
研究思路
研究结果
作者对一只雌性红喉北蜂鸟的脑组织进行Nanopore测序，共生成了26Gb的长读数据，N50读长为40kb，Illumina NovaSeq测序短读数据为240Gb。接着，作者使用MaSuRCA进行混合组装，将短的reads组装成“super-reads”，然后将其与长的reads对齐以创建“mega-reads”。然后将这些“mega-reads”组装成contigs。以其他蜂鸟的全基因组序列作为参考基因组，将红喉北蜂鸟的基因组组装到染色体水平，组装后的基因组共包含33条染色体，总长度为1.1Gb，N50为46Mb。经过校正后，作者还对该基因组的重复序列进行了注释，共检测到了16Mb的重复序列，占整个基因组的14.83%，TE序列占10.5%，与其他禽类重复序列含量一致。在所有重复序列中，LINE/CR1占6.95%，LTRs占2.57%，未分类的占2.5%。
转录本的组装也是通过长短reads结合的方式，组装后的转录本通过Liftoff工具进行初步注释，再使用StringTie2基于混合组装管道进行深度注释，最终获得17,878个基因和43,348个转录本，并鉴定出了8,705个多转录位点，平均每个基因2.4个异构体。利用blast对基因进行功能注释，发现了对新陈代谢至关重要的基因，包括ALDOA、PFKM、G6PD等。此外，混合组装的转录组中每个基因的同工酶变异数量变多了，例如溶质运载体家族2成员5（SLC2A5），以前称为GLUT5。
为了找出红喉北蜂鸟基因组中的正选择基因，作者结合19个高质量禽类的基因组数据，使用OrthoFinder鉴定这些物种之间的同源基因簇，根据基因序列的相似性将基因分为正交群，结果发现97.9%的基因都被归入了正交群，共包含354,573个基因，其中7,799个（42%）在所有物之间共有，1,848个基因为单拷贝基因。通过PAML分析，作者找到了148个正选择基因，GO富集分析显示这些基因主要富集在大分子（蛋白质、酰胺、氮、有机物）转运、定位、骨骼肌组装和胰岛素分泌等通路中。此外，作者还发现了参与脂肪生成的基因（HACD3、BDH2）也受到了正选择，这些基因可能有助于禁食状态下蜂鸟快速的将脂肪合成和分解。PROX1和LMOD1等可能有助于蜂鸟胸肌维持悬停飞行的基因也受到了正选择。最后，作者还发现了对糖酵解过程至关重要的一种基因（GAPDH）。
为了解析红喉北蜂鸟糖类代谢的机制，作者利用长读cDNA的数据，定量分析了肌肉和肝脏中SLC2A5转录本异构体的相对丰度，并鉴定了肌肉和肝脏组织之间发生的差异选择性剪接。结果显示肌肉SLC2A5中有更多的跳过外显子3的异构体表达，导致跨膜结构域TM3、TM4和TM5胞内顶端缺失。尽管果糖转运体基因SLC2A5的高表达量表明，蜂鸟摄取果糖的能力足以在悬停飞行过程中满足其水解和氧化果糖的需求，但其体内果糖高磷酸化率的酶学基础仍不清楚。哺乳动物肝脏中果糖代谢的第一步是通过酮六磷酸酶（KHK）的磷酸化，而在人类和红喉北蜂鸟中的肌肉中主要表达己糖激酶2（HK2），这是一种人类葡萄糖特异性激酶。蜂鸟的KHK和HK2基因与人类同源基因的同一性分别为65%和87%，表明它们的底物亲和性可能与人类的同源基因不同。
通过同位素示踪剂的方法，该研究追踪了纯蔗糖膳食在蜂鸟体内的即时氧化过程，通过呼出一氧化碳的13C特征，结合呼吸测定法，每隔1分钟测量一次示踪剂的即时氧化率。最终发现富含果糖的蔗糖溶液达到示踪剂氧化峰值的时间比富含葡萄糖的蔗糖溶液快，说明表明蔗糖中的果糖的氧化更快。总的来说，这些数据支持一个假设，即果糖在蜂鸟体内会被迅速运出血液并被代谢。相比之下，葡萄糖在血液中停留的时间长，并且可以在血液中果糖水平下降后被用作燃料来源。
为了鉴定对禁食快速响应的差异表达基因（DEGs），作者分析了自由喂食或禁食1小时的蜂鸟肌肉和肝脏总mRNA的转录组，然后在在肝脏转录组中发现了140个调整后P值低于0.1的DEGs，在肌肉转录组中则发现了191个DEGs。GO富集后，肝脏和肌肉差异基因分别富集到了200条和106条显著的通路中。该结果显示在肝脏中，禁食1小时影响了许多代谢和稳态的途径，包括辅酶生物合成过程、细胞对营养水平的反应、脂肪酸代谢过程、稳态过程和对糖皮质激素刺激的反应等。在这些过程中受到影响较大的基因是代谢通量的关键调节因子，包括PDK4、G0S2和ANGPTL4，它们可能有助于蜂鸟肝脏在急性食物戒断期间向脂质代谢的快速过渡。在禁食组肌肉差异基因的富集结果中，最具统计学意义的上调途径是线粒体ATP合成耦合质子运输（GO:0042776，P=1.9×10−6）。其他调节代谢通量的关键基因如ENHO、PPARA、G0S2和SREBF1也受到了影响。其中，G0S2是唯一被鉴定为在肝脏和肌肉组织中均有差异表达的基因。虽然已知G0S2似乎也存在于线粒体中，在肝脏脂质转运中具有重要作用，但其在骨骼肌中的实际作用尚未阐明，推测其可能具有多种功能。这些结果表明G0S2在蜂鸟快速代谢通量中可能具有重要作用。
研究总结
总之，该研究利用了最先进的长短reads结合的技术，对红喉北蜂鸟进行了高质量的基因组和转录组组装和注释。基于此，作者对红喉北蜂鸟维持悬停飞行时体内脂肪和糖类代谢的机制进行了探究，检测到了多种与代谢相关的基因和通路。作者认为后续还需要通过生化实验对相关酶的性质进行研究，或者通过x射线晶体学或冷冻电镜进行结构生物学的研究，将蜂鸟基因与其他鸟类或哺乳动物物种的同源基因进行比较，这样才能更好地了解蜂鸟体内这些重要的代谢途径。
参考文献
Gershman A, Hauck Q, Dick M, Jamison JM, Tassia M, Agirrezabala X, Muhammad S, Ali R, Workman RE, Valle M, Wong GW, Welch KC Jr, Timp W. Genomic insights into metabolic flux in hummingbirds. Genome Res. 2023 May;33(5):703-714. doi: 10.1101/gr.276779.122. Epub 2023 May 8. PMID: 37156619; PMCID: PMC10317124.
