今天和大家分享的是2020年4月发表在Cancers（IF：6.162)上的一篇文章，“Pan-Cancer Analysis of Radiotherapy Benefits and Immune Infiltration in Multiple Human Cancers”，作者对TCGA数据库中的7种癌症数据集样本使用ESTIMATE和CIBERSORT计算免疫分数和免疫细胞亚群丰度，分析免疫浸润与放疗效果之间的关系，并且在乳腺癌数据集中通过LASSO-COX回归构建了以免疫浸润为基础的放射敏感性signature预测模型。
Pan-Cancer Analysis of Radiotherapy Benefits and Immune Infiltration in Multiple Human Cancers
多种人类癌症的放疗效果与免疫浸润的泛癌分析
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一、研究背景
放疗（RT）是约60％的新诊断癌症患者的主要治疗方法，由于肿瘤放射敏感性的差异，并非所有患者都能从放疗中获益，因此放射敏感性预测一直是个体化治疗的重要研究内容。肿瘤微环境TME与肿瘤的生长，转移以及对临床治疗的反应密切相关，最近认为TME对设计RT治疗方案具有重要意义。辐射可能诱导新抗原的释放，并触发免疫系统激活肿瘤特异性T细胞，并且可以增强TME的免疫浸润。作者希望全面评估RT中可能与不同癌症类型相关的免疫浸润，综合分析RT结果与免疫浸润的相关性。
二、分析流程
三、结果解读
1.TCGA数据中样本特征
首先作者对TCGA中的每种癌症进行了综合分析，根据接受RT的样本数量及比例选择其中7种癌症进行后续分析，并以RT及免疫分数对样本进行分组。
图A展示了每种癌症类型的样本数，并以接受RT的样本数进行排序，图B展示接受RT的样本百分比，红色为接受RT的样本。
图C中作者选择总样本量大于50且RT接受比例大于30％的癌症进行后续分析：乳腺浸润癌（BRCA），脑低度神经胶质瘤（LGG），甲状腺癌（THCA），头颈部鳞状细胞癌（HNSC），子宫内膜子宫内膜癌（UCEC），宫颈鳞状细胞癌和宫颈内膜腺癌（CESC）和多形胶质母细胞瘤（GBM）。
图1D中作者以ESTIMATE算法计算样本组织的免疫分数，作为样本的免疫浸润水平，免疫分数>0的样本为免疫阳性，<0的样本则为阴性。并以免疫浸润水平(Immu+/-)及是否接受RT(RT+/-)将患者分为abcd四组，进行后续分析。
图1：TCGA样本的RT信息
2.免疫浸润水平与RT结果的泛癌分析
由于目前癌症分期为RT治疗的重要指标，作者在以上7种癌症类型中对临床分期与组织学分级进行单因素Cox分析（表1），结果显示癌症分期并非通用的RT结果指标。免疫浸润水平与癌症分期之间具有相关性，作者进一步研究免疫浸润与RT结果之间的关系，以作为现有RT临床指标的补充。
表1：7种癌症中癌症分期的单因素Cox分析
根据图1D中的abcd组，图2作者对7种癌症分别进行了五种不同的生存分析（编号1-5）：(a+b)与(c+d)，(a)与(b)，(a)与(c)，(b )与(d)，(c)与(d)，结果表明免疫浸润水平与患者的RT结果相关。
第一列结果表明并非所有类型的癌症都能从RT中受益。
第二至第四列评估免疫浸润与患者预后之间的关系，分析还包括未接受放疗的患者，列出了所有可能的亚组。
对于BRCA患者，RT治疗组的OS显著更好（图A1），且高水平的免疫浸润改善了BRCA患者的OS（p = 0.0186，图A2）。
对于免疫阴性的LGG患者，RT可以显著改善OS（p = 0.0001，图E5）。
对于免疫阳性的HNSC和GBM患者，RT显著改善OS（图D4，p = 0.0208；图C4，p = 0.0001）。
相对而言，RT和免疫浸润对THCA、UCEC、CESC患者没有影响（图2F，图2G，图2B）
图2：7种癌症中不同RT与免疫浸润分组的生存分析
3.TME中免疫细胞亚群与RT结果的泛癌分析
免疫浸润水平由TME中的免疫细胞类型、数量和相互作用决定，在抵抗或加速患者肿瘤生长中发挥重要作用。作者进一步分析了接受RT治疗的患者样本中与预后相关的免疫细胞。
使用CIBERSORT算法对表达谱进行分析，评估样本的免疫细胞亚群丰度，并对样本进行了无监督的层次聚类。图A为7种癌症患者中22种免疫细胞的丰度热图，显示免疫细胞组成在不同类型的癌症之间明显不同。
在多种癌症中静息CD4记忆T细胞、M2巨噬细胞和CD8 T细胞的丰度较高，而γδT细胞、幼稚CD4 T细胞和记忆B细胞在所占的比例较低。
在所有癌症中，神经胶质瘤组织的M2巨噬细胞和单核细胞百分比最高。
作者进一步根据免疫细胞的丰度计算了22种免疫细胞之间的相关系数，并且使用Cytoscape对相关系数网络进行了可视化（图B–H），显示出不同类型癌症中免疫细胞之间的相关性差异很大。
图3：7种癌症类型种免疫细胞的组成及相关性
基于图3中的结果，作者认为免疫细胞亚群丰度的差异可能是个体差异的重要指标，具有预后意义。进一步在7种癌症类型种以22种免疫细胞亚群丰度分组，进行生存分析。
结果显示有8种免疫细胞与RT结果相关，图A的雷达图展示了8种免疫细胞及其作用等级，其中CD4记忆T细胞激活和肥大细胞激活与多种癌症类型的RT结果相关。
图B–P展示了与RT结果具有显著相关性的细胞，表明这些免疫细胞亚群可能为RT的预后判断提供补充指标。蓝色为低丰度组，红色为高丰度组，对应不同类型的癌症BRCA（B），CESC（C–F），GBM（G），HNSC（H，I），LGG（J），THCA（K–P）。
一些免疫细胞亚群可能在不同类型的癌症中对RT结果产生相反的影响，图J中肥大细胞激活可以改善LGG患者的10年OS，而在图C,M中不利于CESC和THCA患者的10年OS。CD4记忆T细胞激活可以改善BRCA（p = 0.006）和CESC（p = 0.015）的RT结果，但不利于GBM（p = 0.001）患者的预后。
图4：7种癌症类型中22种免疫细胞的预后价值
4.构建BRCA中基于免疫浸润细胞的Radiosensitivity Signature
作者对免疫浸润水平的RT结果预测价值进行了进一步分析和验证，通过差异基因筛选、生存分析和LASSO-Cox回归，在BRCA中构建radiosensitivity signature（RSS）。
首先作者以临床信息、是否接受RT治疗为条件，从TCGA数据集中选择了314个BRCA样本，并将这些样本随机分为训练集和验证集。
在训练集中以高低免疫浸润水平对样本进行了差异基因分析，并且对268个筛选出的DEGs进行了生存分析，得到65个与RT患者OS显著相关的基因，通过单变量回归分析进一步筛选出14个与OS相关的基因。
图6A,B中作者对14个OS相关基因进行了LASSO-Cox回归分析，选择合适的λ，最终构建了一个3基因signature的RT预后模型RSS。图6C中显示3基因的HR均显著<1，表明其可以作为RT预后的保护因子。图6D,E展示了以RSS将患者分为高低风险组以及组间生存时间和状态的分布差异。
图6F展示高风险评分和低风险评分患者的3基因表达热图。最后ROC曲线显示RSS在训练集中AUC面积为0.853（图G），使用相同的免疫细胞浸润评分公式验证验证集中风险评分的诊断价值，AUC面积为0.79，表明RSS具有较好的预测能力。验证集中的单因素和多因素Cox回归显示风险评分是独立的预后指标，具有良好的预测性能。
以上结果表明免疫浸润是临床放疗管理和预测放疗结果准确性的重要指标。
图5：RSS的构建和验证
小结
这篇文章的思路很简单，对TCGA数据库中所有癌症种类的RT样本信息进行分析，选出其中7种RT治疗接受比例高的癌症，使用ESTIMATE和CIBERSORT分别计算了样本的免疫分数和免疫细胞亚群丰度，之后分别分组进行生存分析。作者还对BRCA数据集中的RT样本以免疫分数进行DEGs的筛选，并对DEGs进行生存分析、单因素Cox分析，进一步筛选与RT预后相关的DEGs，最后进行了LASSO-Cox回归建立RSS模型，并使用验证集对RSS的RT预后价值进行了评估。
本研究证实了肿瘤浸润免疫细胞丰度与RT结果密切相关，确定出在多种癌症中与RT结果相关的肥大细胞激活、CD4 记忆T细胞激活，但免疫细胞与RT结果的关系在不同癌症类型、不同患者之间具有很大差异，作者仅根据免疫浸润水平构建了BRCA中的RSS，而更具体的免疫细胞定位与RT结果之间的关系仍需进一步研究。
