前言
个人觉得还是很有必要搞清楚测序原理和样本制备以及样本质量标准等等一些列环节的关节问题，如此才能全方位把控整个项目的质量。
RNA-Seq的原理
我在一年前看过超过9个视频简介，但是还是没学得咋样，这两天在家又看了一遍陈巍学基因，大致明白了illumia的测序原理，可见学习有时候需要循序渐进，即使一开始花了很大的苦功，也不见得就可以理解。
1. 首先在芯片上有共价键连接的DNA引物；
image.png
通道内表面有共价键连接的2种引物
image.png
flowcell的内部结构
image.png
2. DNA文库：DNA片段加上两端的DNA接头；
image.png
3. DNA文库加入到芯片中后，通过引物互补杂交就可以固定住文库，加dNTPs和酶之后，就可以通过扩增出文库互补链；
image.png
image.png
4. 加入碱液解链，冲走文库，留下互补链（因为互补链的引物是共价连接在芯片上的）；
image.png
5. 加入中和液后，留下来的互补液会弯腰下来，和芯片上的另外一种引物互补结合；加入dNTPs和酶，就可以合成新的互补链。
image.png
合成新的互补链
6. 加碱液，解链，只留下和芯片共价结合的链；再加中和液，再反应，如此循环，完成扩增。
image.png
image.png
7. 之后就是边合成边测序了，那么现在需要测序引物和聚合酶以及带荧光标签的dNTPs合成，每合成一个读一次，不断循环。
image.png
image.png
8. 读取index：先把read1冲走，加入read2的引物。
image.png
image.png
9. 双端测序：先倒链合成出互补链，然后解链，冲走，按照第一端的原理再读一遍。
image.png
image.png
10. 数据量非常大
image.png
感兴趣的话，最好把HiSeq测序仪的原理学一下，这里我就不放了。
image.png
