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title：Integrating microarray-based spatial transcriptomics and single-cell RNA-seq reveals tissue architecture in pancreatic ductal adenocarcinomas
标题：结合基于微阵列的空间转录组和单细胞RNA-seq揭示胰腺导管腺癌的组织结构
杂志：nature biotechnology ；发表时间：13 January 2020

通讯：Itai Yanai

样本信息：

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分析方案

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结果一：单细胞测序鉴定细胞类型

病人A和病人B同时进行单细胞和空间转录组测序。每个细胞大约表达2,500–3,300个UMIs和1,400–1,700个基因。

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细胞聚类：递归层次聚类（recursive hierarchical clustering scheme），采用了KNN) smooth算法。病人A和B分别鉴定出15和11个populations。

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注释到相同细胞类型的不同病人样本间的基因表达谱具有强相关性，从一定程度上证明了注释的可靠性。

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结果二：使用inferCNV分析区分癌细胞和非癌细胞，在病人A和B中分别有两个和一个cluster异常。

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结果三：空间转录组测序分析

首先，对冰冻切片采用H&E染色成像

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根据H&E染色图像，每个spot大约含有20-70个细胞，不同区域细胞数量差异可能较大。例如，结缔组织密集的高纤维化区域(因此细胞含量较低)每个点的细胞数量可能比细胞密度高的区域(如胰腺的腺泡)低。

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每个spot大约含有2400个UMIs和1000个基因。

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空间转录组数据某些基因表达注释与病理学区域注释相匹配：见从这里往上面第三幅图的c，d。使用的基因有：

• 病人A组织：CRISP3，PRSS1，TM4SF1；
• 病人B组织：COL1A1，MUC4，MUC5B

然后，使用空间转录组数据进行组织切片空间划分

空间转录组分类与组织染色注释分类相匹配。

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结果四：单细胞数据与空间转录组数据相结合分析：Multimodal intersection analysis (MIA)

这是本篇文章的重点结果所在，单细胞数据具有细胞水平的高分辨率但是没有空间位置信息，空间转录组具有空间位置信息但是分辨率较低。

• 如何将两者联系起来是的在单细胞水平分类注释得到信息能够对应到具体的实体切片组织中呢？
• 单细胞水平中同一个类别的细胞在空间上是否都聚类到一起了呢？
• 如果没有，又是为什么呢？

超几何分布检验：单细胞数据细胞分类marker基因与空间转录组区域类marker基因之间是否显著的重合。

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结果五：跨组织区域细胞类型亚群的识别和定位。

ductal cells群进行再一次细分：这种类型的细胞高表达KRT19基因，是胰腺外分泌系统的两种主要细胞类型之一，再次分类分成了四个亚类：

• a ductal population expressing APOL1 and hypoxia-response-related genes including ERO1A，表达APOL1和低氧反应相关基因ERO1A的导管群**
• a terminal ductal population expressing TFF1, TFF2 and TFF3，表达TFF1、TFF2和TFF3的末端导管群**
• a centroacinar ductal population expressing CRISP3 and CFTR，表达CRISP3和CFTR的腺泡中心导管群**
• antigen-presenting ductal cells expressing major histocompatibility complex (MHC) class II genes CD74, HLA-DPA1, HLA-DQA2, HLA-DRA, HLA-DRB1* and HLA-DRB5 and complement pathway components C1S, C4A, C4B, CFB and CFH，表达主要组织相容性复合体(MHC) II类基因的抗原呈递导管细胞和补体成分*

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值得注意的是，过去的工作研究胰腺导管细胞单细胞分辨率报道存在的终端和泡心ductal subpopulations，但没有发现人群中显示特定的受体或APOL1-high /低氧基因标记温度出现在这里描述的PDAC导管细胞肿瘤。

实验证实了这些亚群的存在：

我们对存档的FFPE患者组织进行了双重免疫荧光检查，我们发现亚群标记与导管标记KRT19共定位，确认了这些导管细胞亚群的存在。（上图的e-f）

PDAC-A macrophages细分：两个亚类

• expressed IL1B corresponding to an inflammatory M1 state
• resembling the M2 alternatively activated state based on its expression of CD163 and MS4A4A

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dendritic cells细分：两个亚类

• subpopulation B expressing higher levels of complement pathway genes and MHC class II
• subpopulation A was most enriched in pancreatic tissue

结果六：肿瘤微环境中细胞状态关系去卷积

主要关注癌细胞在空间组织中的分布以及联系

由于ST提供了空间信息，我们询问是否可以使用MIA方法将癌细胞状态映射到不同的空间组织区域，并描述它们与其他细胞类型的相互作用。
这个分析新增了一个了病人样本C的单细胞测序，然后将A，B，C合并进行分析。

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其他结果

结合TCGA bulk RNA-Seq测序数据进行分析（上图的D）

对其他癌症的公开数据集合进行MIA分析