- PMID: 33288955 https://www.nature.com/articles/s41596-020-00409-w#Sec1
- DOI: 10.1038/s41596-020-00409-w
单细胞RNA测序（scRNA-seq）是一种流行且功能强大的技术，它允许您分析大量单个细胞的整个转录组。然而，分析这些实验产生的大量数据需要专门的统计和计算方法。这里我们概述了处理scRNA序列数据所涉及的计算工作流程。我们将讨论一些最常见的任务和解决中心生物学问题的工具。在本文和我们的指南网站(https://scrnaseq-course.cog.sanger.ac.uk/website/index.html)，我们提供有关执行计算分析的最佳实践的指南。本教程为有兴趣分析数据的实验者提供了实践指南，也为寻求开发新计算方法的生物信息学家提供了概述。
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介绍
scRNA-seq已成为一种转化技术，用于表征复杂组织，并回答无法通过批量RNA测序解决的问题。自2009年第一个scRNA-seq协议发布以来，许多协议和商业平台已经发布。如今，scRNA-seq实验有两种主要模式。最常见的方法是使用显微镜下的复制品或孔来分离大量细胞，然后对文库进行相对较浅的排序4,5。为了确定给定转录本来自哪个细胞，这些方法使用了细胞弧（附在每个读数上的短核苷酸标签是液滴或井所特有的）。这种高通量、低深度的模式是使用流行的10×Chromium平台进行实验的典型模式。这项技术的一个重要优点是它支持独特的分子标识符（UMI）。UMI是在扩增前附加在转录本上的短条形码，使得消除聚合酶链反应重复并获得更准确的表达水平估计成为可能。一个主要缺点是该平台仅允许对每个信使RNA（mRNA）的5′或3′端进行测序。许多研究采取了相反的方法，即分离相对较少的细胞，但更深入地排列它们。这些低通量、高深度的实验通常将细胞分离到单个孔中，并应用Smart-seq2协议。除了最近引入的Smart-seq3协议外，这些方法不支持UMIs，但它们通常显示出比基于液滴的技术更高的灵敏度，并且它们还允许对整个转录本进行分析。有关不同平台的深入概述，请参阅最近的综述和相关标准。
除了促进实验工作流程外，最近的创新还大大降低了scRNA-seq的每细胞成本。因此，就所分析的细胞数量而言，出现了指数增长。鉴于生成的数据量巨大，单细胞数据分析需要高效的计算和统计方法。随着实验协议的迅速改进，处理数据的计算工作流也得到了改进。本教程的目的是为scRNA序列数据提供最常见分析类型的概述。本文旨在作为我们为教授scRNA-seq数据的计算分析而开发的课程材料的配套(https://scrnaseq-course.cog.sanger.ac.uk/website/index.html)。该网站于2016年首次推出，并不断更新，包括新方法，并提供最新的最佳实践建议。
scRNA序列分析的一个核心组成部分是表达矩阵，它代表每个基因和细胞的转录数量。工作流程可分为两个主要部分：1）表达式矩阵的生成，2）表达式矩阵的分析（图1和表1）。尽管我们的在线教程涵盖了这两个方面，但这里我们重点介绍了获得表达式矩阵后执行的分析类型。大多数基因只在一组细胞类型中使用，但是，由于在scRNA-seq实验中普遍使用的起始材料量低和测序深度低，一些基因即使表达也无法检测到。结果是基因表达矩阵中存在大量的零值，这是一个问题，因为一些零值可以代表细胞中实际的低或零表达以及测量过程中的变化。难以区分这些观察到的零值并对其进行适当建模是计算分析的主要挑战之一。即使是深度测序的数据集也可能有约50%的零，而测序深度较低的数据集可能有99%的零。相比之下，在非典型批量RNA测序数据集中，<20%的数据条目为零。
图1 | 工作流程概述。在典型场景中，研究人员必须首先组合多个实验中的表达矩阵，以获得一个组合表达矩阵，该矩阵根据测序深度、细胞周期阶段和其他混杂因素进行校正。接下来，数据被可视化，并通过聚类、伪时间和差异表达分析来识别具有生物学意义的模式。最后，将结果与文献和现有数据集进行比较。
质量控制
分析scRNA序列的第一步是排除不太可能代表完整单个细胞的细胞条形码。对于高通量方法，关键步骤是过滤掉不代表单个细胞的barcode。
最直接的方法是计算需要考虑条形码作为ACEL11的UMI的数据集特定阈值。或者，一些最近开发的工具，如MPT-HYDROPS12，首先估计存在于空孔或液滴中的RNA的背景水平，然后识别明显偏离背景的细胞条形码，这表明存在细胞。这种策略的优点是，相对于样本中的其他细胞，它能够检测RNA含量较低的细胞类型。
不幸的是，这些方法都不能区分完整的活细胞和受损或垂死的细胞。必须执行第二轮质量控制，考虑检测到的基因数量、来自线粒体基因组的 RNA 比例以及每个细胞不可映射或多映射读数的比例。具有高比例的线粒体衍生基因、很少检测到的基因或高比例的未映射或多映射读数的细胞通常是受损或死亡的细胞13。 具体阈值通常是通过手动检查质量控制指标图来确定的，因为最佳截止值取决于组织、解离协议和其他技术因素。为关键指标定义离群细胞（根据中值绝对偏差）允许直接构建数据集特定阈值，但应谨慎应用，尤其是对于包含高度异质细胞类型的样本14。
