题目Strand-specific single-cell methylomics reveals distinct modes of DNA demethylation dynamics during early mammalian development
中文题目链特异性单细胞甲基组学揭示了哺乳动物早期发育过程中DNA脱甲基动力学的不同模式
阅读日期2022/7/29发表日期
作者(学校)Maya Sen1,8, Dylan Mooijman1,7,8, Alex
Chialastri 2,3,8, Jean-Charles Boisset1, Mina Popovic4, Björn Heindryckx 4,
Susana M. Chuva de Sousa Lopes 4,5, Siddharth S. Dey 2,3,6✉& Alexander van Oudenaarden 1
作者介绍 University Medical Center Utrecht
摘要DNA甲基化（5mC）是细胞识别的核心。在着床前哺乳动物发育过程中，从亲本基因组中全局擦除5mC对于将配子的甲基体重置为胚泡中的细胞至关重要。虽然主动和被动脱甲基模式都被认为在这一过程中发挥作用，但这两种机制对5mC擦除的相对贡献仍不清楚。在这里，我们报告了一种单细胞方法（scMspJI-seq），该方法能够实现5mC的链特异性定量，使我们能够系统地探索全局去甲基化的动力学。当应用于小鼠胚胎干细胞时，我们发现了大量细胞间特定于细胞链的5mC异质性，一小群细胞在染色体的两条DNA链之间显示出不对称的5mCpG水平，表明维持甲基化缺失。其次，在植入前小鼠胚胎中，我们发现甲基化维持在16细胞阶段是活跃的，然后在32细胞发育阶段早期囊胚内的一部分细胞中发生被动去甲基化。最后，人类植入前胚胎定性地显示出与小鼠胚胎类似的时间延迟但类似的去甲基化动力学。总的来说，这些结果表明，scMspJI-seq是一种敏感且经济高效的方法，用于绘制单个细胞中5mC的链特异性全基因组模式。
过往研究后来的研究表明，虽然DNMT1在发育的早期阶段主要是细胞质，但在细胞核中观察到低水平的DNMT1亚型DNMT1s和UHRF1，增加了母体基因组12-19上维持5mC的可能性。然而，最近这些研究中的结论部分基于基于亚硫酸氢盐测序的方法，这些方法不能直接区分主动脱甲基和被动脱甲基，因此这两种机制对5mC重编程的相对贡献仍不清楚。
思维导图
结论使用scMspJI-seq对5mC进行链特异性定量
mES细胞显示出链特异性5mC的异质性
胚胎显示出不同的去甲基化动态模式
方法scMspJI-seq
在进行FACS或手动分离单细胞之前，384孔板（BioRad）准备如下。
使用多通道移液器将4μL Vapor-Lock（Qiagen）手动加入每个孔中，然后使用Nanodrop II液体处理机器人（BioNex Solutions）加入2μL裂解缓冲液（0.2μL 25μg/μL Qiagen蛋白酶，0.2μL 10× NEB
Buffer 4和1.6μL无核酶水）。所有的下游分装步骤都是使用液体处理机器人进行的。
旋下384孔板后，将单细胞沉积到板的每个孔中，在50℃下培养15小时，75℃下培养20分钟，80℃下培养5分钟。然后将基因组中的5hmC位点葡糖化，以阻断MspJI的下游识别，方法是分配0.5μL以下反应混合物。0.1μL T4-BGT（NEB），0.1μL UDP-葡萄糖（NEB），0.05μL 10×NEB Buffer 4，和0.25μL无核酸酶水。在37℃孵育16小时后，加入0.5μL以下反应混合物：0.1μL 2 5μg/μL Qiagen蛋白酶，0.05μL 10×NEB缓冲液4，和0.35μL无核酶水。然后将平板在50℃下培养5小时，75℃下培养20分钟，80℃下培养5分钟。此后，加入0.5μL以下反应混合物，用限制性酶MspJI消化gDNA。0.02
μL MspJI（NEB），0.12 μL 30×酶激活液（NEB），0.05 μL 10×NEB缓冲液4，和0.31 μL无核酸酶水。消化在37℃下进行5小时，然后在65℃下对MspJI进行20分钟的热灭活。接下来，在各个孔中加入0.2μL细胞特异性双链适配体，并通过加入0.8μL以下反应混合物将这些适配体连接到破碎的gDNA分子上。0.07 μL T4 DNA连接酶（NEB），0.1 μL T4 DNA连接酶缓冲液（NEB），0.3 μL 10 mM
ATP（NEB），和0.33 μL无核酸酶水。接下来，使用多通道移液器将含有独特的细胞特异性适配器的孔汇集起来，并与0.8×Agencourt Ampure（Beckman Coulter）珠子孵育30分钟，用80%的乙醇洗涤两次，并重新悬浮在6.4μL无核酸酶的水中。此后，体外转录和Illumina文库的制备按照之前scAba-seq protoco中的描述进行
scMspJI-seq adapters
双链scMspJI-seq适配体被设计为包含一个T7启动子，5′Illumina适配体，3bp UMI，8bp细胞特定的条形码，和一个随机的4核苷酸5′悬边。顶部和底部链的一般设计如下
Top oligo:
5′–CGATTGAGGCCGGTAATACGACTCACTATAGGGGTTCAGAGTTCT ACAGTCCGACGATCNNN[8 bp cell-barcode]–3′
Bottom oligo:
5′–NNNN[8 bp cell-barcode]NNNGATCGTCGGACTGTAGAACTCTGAACCCCTATAGTGAGTCGTATTACCGGCCTCAATCG–3′
8bp细胞特异性条码的序列在补充表1中提供。磷酸化底层链和退火顶层和底层链以产生双链适配体的协议在之前的scAba-seq协议中有所描述
讨论链特异性5mC景观的细胞间差异很大，揭示了mES细胞甲基组中存在全染色体的异质性
scMspJI-seq还能系统地调查调节去甲基化动态的机制
贡献
感悟DNA甲基化(5mC)促进细胞分裂过程中的细胞特性传播和限制终末分化细胞的发育潜力方面发挥着重要作用
了解全球DNA脱甲基动力学的潜在机制对于理解早期发育过程中多能干细胞的出现至关重要
5mC的去除：被动和主动脱甲基。在CpG二核苷酸环境中，甲基化胞嘧啶通常通过维持甲基转移酶DNMT14在基因组复制期间复制到新合成的DNA链上。被动去甲基依赖于通过复制稀释损失5mC，抑制DNA甲基化维持导致细胞分裂后5mC水平降低，并可通过染色体两条DNA链上的不对称5mC水平检测到。或者，5mC擦除的活性机制是通过5mC转化为5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）和其他氧化衍生物发生的，这些衍生物不被DNA维持甲基化机制识别，随后通过碱基切除修复途径去除。
父系基因组通过在受精卵中转化为5hmC主动去甲基化，母系基因组在复制过程中缺乏DNMT1活性而经历被动去甲基化
DNA甲基化的维持可以通过单细胞中5mC的链特异性定量来探测。细胞在染色体的两条DNA链上显示对称水平的5mCpG，再加上5mCpG的整体时间损失，表明主动去甲基化，而在两条DNA线之间出现不对称水平的5mCpG，则表明被动去甲基化。通过流式细胞仪或手动移液器分离的
文章亮点scMspJI-seq提出了一种单细胞链特异性技术，有可能被用来探测发育、癌症进展、衰老和其他生物系统中的甲基化动态
单细胞方法（scMspJI-seq），该方法能够实现5mC的链特异性定量，使我们能够系统地探索全局去甲基化的动力学
单细胞沉积在384孔板中并裂解。在蛋白酶处理去除染色质并通过葡萄糖基化阻断5hmC位点后，MspJI用于识别5mC位点并切割甲基化胞嘧啶下游16 bp的gDNA。将含有细胞特异性条形码（CB，粉红色）、随机3 bp唯一分子标识符（用于标记不同等位基因（UMI，绿色）、5′Illumina适配器（IL，蓝色）和T7启动子（T7，灰色）上的单个5mC位点）的双链适配器连接到片段gDNA后，来自所有单个细胞的分子被汇集并通过体外转录进行扩增。扩增的RNA分子用于制备scMspJI序列库，并在Illumina平台上测序
通过荧光激活细胞分选或手动移液将单个细胞分离到384孔板中。随后使用液体处理平台（Nanodrop II，BioNex溶液）执行所有下游步骤。在细胞裂解和蛋白酶处理以去除染色质后，使用T4噬菌体β-葡萄糖基转移酶（T4-βGT）对基因组DNA（gDNA）中的5hmC位点进行糖基化（图1b）。这种修改阻止了5hmC的下游检测，因此，在scMspJI序列中仅能检测到5mC。接下来，加入限制酶MspJI，以识别基因组中的mCNNR位点，并在甲基化的胞嘧啶下游产生16bp的双链DNA断裂，留下4-核苷酸5‘端的悬垂。然后，将含有4-核苷酸3′悬突的双链DNA适配器连接到片段gDNA分子。这些双链DNA适配体的设计与我们以前开发的类似，包含一个细胞特异性条码，一个随机的3bp唯一分子标识符（UMI），用于标记不同等位基因上的单个5mC位点，一个5′Illumina适配器和一个T7启动子。然后通过体外转录扩增连接分子，并用于制备Illumina文库，如前所述，每天可以处理数百到数千个单个细胞
MspJl 是经 EpiMark 验证过的产品，是一种修饰依赖型核酸内切酶，能够识别 mCNNR 位点并能在修饰的胞嘧啶 3´ 一侧 N9/N13 处切割双链 DNA。能被识别的胞嘧啶修饰有：C5-甲基化胞嘧啶（5–mC）和 C5-羟甲基化胞嘧啶（5-hmC）
