皮肤T细胞瘤（CTCL）以其罕见且高死亡率著称，只有1/3的 CTCL 患者从 PD-1 阻断中受益，急需生物标志物来预测抗 PD-1 治疗的临床反应。但基于传统的检测手段如免疫组化、基因表达和质谱的检测方式，无法找到合适的预测性生物标志物。

鉴于此，斯坦福大学医学院、哈佛医学院研究人员发散思维：既然从数量上找不到，那么是不是可以从空间分布上找到差异。研究人员通过空间蛋白组技术 CODEX 对来自 14 名晚期 CTCL 患者（7例为响应组、7例为非响应组）进行研究。针对治疗前后的肿瘤石蜡组织（FFPE），取其中70个区域制备成组织芯片用于蛋白检测，同时通过连续切片取相邻样本进行 bulk RNA-seq，对数据进行联合分析，发现 PD-1+CD4+T 淋巴细胞、肿瘤细胞和 Treg 细胞的空间距离可作为空间标志物（SpatialScore）预示药物是否响应。

茵菲生物可提供空间蛋白组（IMC、CODEX、mIHC）、空间转录组（10x Visium）、scRNA-seq、单细胞免疫组库测序、CITE-seq 等单细胞&空间技术完整解决方案，并且也可提供多组学技术联合分析方案。

1、患者队列和多模式实验方法

研究人员通过 CODEX 设计了56个蛋白抗体的Panel检测方案，其中包括：33种蛋白可以识别 T、B、NK、DC 等免疫细胞及肿瘤细胞，14种功能性蛋白以及9种基质/结构蛋白。56种标志物最终识别21种细胞型有效，其中有13种免疫细胞型（产生效应的 CD4+T 细胞），6种辅助 T 细胞型，2种肿瘤细胞型（免疫抑制的CD4+T细胞）。

图1 研究方案

在治疗前或治疗后，响应组和无响应组之间的细胞组成没有差异，与治疗前相比，治疗后响应组的免疫激活基因评分显著增加，无响应组的免疫激活基因评分没有显著变化。

这些发现表明，1）相对于响应组，无响应组具有免疫抑制的表型；2）只有响应组在 pembrolizumab 治疗后才出现免疫激活的 TME；3）CTCL TME 的功能免疫状态取决于原始免疫细胞数量以外的因素。

图2 抗PD-1免疫治疗对 CTCL TME 的影响

2、细胞邻域（CN）分析

研究人员通过选定合适的窗口（Window size 10：以单个细胞为中心周围的9个细胞），确定了10种在 CTCL 患者组织中不同类型的 CN，通过 Heatmap 将不同的细胞类型和 CN 进行相关性分析，最终将这些 CN 原位标记在组织上，生成可视化的 Voronoi 图。

研究发现 CN-5（肿瘤和DC细胞）、CN-8（肿瘤和CD4+T细胞）和 CN-10（Treg富集）这三种类型的细胞邻域在响应组和无响应组之间具有明显的差异。在治疗响应组，CN-5 和 CN-8 的频率高于无响应组，这说明治疗后在响应组中能观察到更多的免疫激活可能是由抗原呈递细胞激活 CD4+T 介导的，而富含 Treg 的 CN-10 在无响应组中的出现频率明显高于响应组，这与 bulk RNA-seq 结果保持一致。

图3 CN揭示了响应组和无响应组的空间TME组织的差异

3、PD-1+CD4+T 细胞、肿瘤细胞和 Tregs 的空间特征预测 CTCL 中 Pembrolizumab 的响应

研究人员根据 CN 分析的结果，确定了一种基于 CD4+T 细胞、肿瘤细胞及 Treg 的空间相互作用计算空间评分方法（SpatialScore）。通过计算每一个CD4+T 与其最近的肿瘤细胞和Treg 细胞的距离比来进行评分。发现响应组的空间评分低于未响应组的评分，这个评分差异在治疗后更加明显。由于主要是围绕着 CTCL 患者对于 PD-1 免疫治疗效果的差异进行研究，为使检测结果更具有针对性，将 PD-1 也纳入评分系统，同样发现响应组比非响应组评分低。

图4 SpatialScore 简化方案

为进一步阐明 SpatialScore 的响应机制，研究人员把重点放在细胞毒作用上。与无响应组相比，响应组在 pembrolizumab 治疗后，PD-1+CD4+T 淋巴细胞具有更好的细胞毒作用潜力，这与 SpatialScore 的治疗后效果相吻合。

图5 PD-1+CD4+T 淋巴细胞可以上调细胞毒作用的效应分子的药物响应

4、临床转化

为了满足临床应用高通量检测需求，针对 PD-1+CD4+T 细胞、肿瘤细胞及 Treg 细胞，研究人员最终设计了一个8色的检测方案，发现这个简化的方案在响应组和无响应组之间也表现了一定的差异。

图6 mIHC简化方案

总结

CODEX 分析揭示了预测临床反应的预后空间模式，PD-1+CD4+T 细胞、肿瘤细胞和Treg细胞之间的空间关系使我们获得了与CTCL的 Pembrolizumab 反应密切相关临床的生物标志物：SpatialScore。SpatialScore 方法的提出为识别免疫治疗反应的空间生物标记物和深入表征TME提供了重要的概念基础。通过将高维病理提炼成可在临床实践中常规测量的简化空间度量，SpatialScore 代表了免疫疗法临床应用的重大进步。

【参考文献】Phillips D, Matusiak M, Gutierrez BR, et al. Immune cell topography predicts response to PD-1 blockade in cutaneous T cell lymphoma. Nat Commun. 2021.