第一章单细胞科研：第一节，单细胞技术应用，多细胞疾病模型构建
1#导语 “
1.1 基因组医学为鉴定复杂疾病的生物标志物和可治疗靶标铺平了道路，单细胞RNA测序研究（scRNA-seq）可以表征整个器官中的此类复杂变化。取而代之的是，在多个细胞类型的多个因果机制的分散体是通过其他一些研究。这种复杂性的一个极端后果是可能需要大量的药物才能有效治疗每种疾病。为了解决这个问题，我们理想地需要表征所有与疾病相关的细胞类型和途径，然后优先确定相对最重要的细胞。据我们所知，这两个挑战都没有得到系统解决。一个原因是患者可能无法获得许多细胞类型，另一个原因是缺乏在细胞类型和途径之间进行优先排序的方法。
1.2 作者的策略的普遍适用性通过对151例患有13种自身免疫性，过敏性，感染性，恶性，内分泌性，代谢性和心血管性疾病以及53个年龄和性别匹配的对照的患者进行的前瞻性诊断研究得到了支持。该策略的治疗潜力得到了对这些疾病的基于网络的分析以及对关节炎小鼠模型的研究的支持。综上所述，作者的结果支持我们的策略可能具有优先考虑复杂疾病中治疗和诊断目标的潜力。
2# 试验方法
2.1 试验设计
2.1.1总而言之，本研究描述了构建MCDM并将其用于诊断和治疗的可扩展的分步策略。该策略已通过临床和实验研究验证。该策略基于应用网络工具来组织和分析来自关节炎和人类类风湿性关节炎小鼠模型的scRNA-seq数据。使用来自13种疾病的前瞻性临床研究的表达谱数据和潜在的蛋白质生物标记物进行诊断验证研究。通过对关节炎小鼠模型的治疗研究，使用表型，免疫组织化学和细胞分析作为读数，检查了候选药物。
2.1.2 类风湿关节炎小鼠模型
2.1.3 单细胞RNA-seq数据处理
使用bcl2fastq Conversion和Picard软件将单细胞数据处理为数字基因表达矩阵。从GRCh38（2017年4月，Ensembl）获取用于人类数据（和GRCm38（2017年6月，Ensembl）用于小鼠的读数的索引参考。使用STAR软件获取数据。根据使用STAR软件的作图质量，在下游分析期间仅考虑了与参考基因组的初步比对。通过每个细胞至少有10,000个读数，400个转录本和少于20％的线粒体基因来评估细胞的质量。由于存在文库重复的风险，导致两个或更多细胞共享细胞条形码，因此，基于对转录物计数的高估，可以移除异常值。结果分别获得了7086和1333个细胞用于关节和淋巴结数据。然后使用Seurat [34]将单细胞数据归一化以进行进一步分析。为了减少数据中的噪声，对每个组织矩阵分别进行K最近邻平滑处理，至少使用5个k，或者如果捕获到5000个以上的单元，则要占单元总数的〜0.1％。
#3试验结果
3.1 抗原诱导性关节炎（AIA）小鼠模型的scRNA-seq分析
a AIA鼠标模型的概述。b苏木精和曙红（H＆E）染色后，来自幼稚小鼠和关节炎关节的代表性关节图像。B，骨髓；S，滑膜腔；C，软骨。箭头指示（1）炎性细胞向滑膜的浸润，（2）软骨/骨破坏，和（3）滑膜内膜的增生。c使用参考成分分析（RCA）对seq-well scRNA-seq和细胞类型进行鉴定的示意图。d t-SNE图显示7086个健康和RA关节细胞（n = 4个健康小鼠样品和5个患病小鼠样品）以及1333个健康和AIA淋巴结细胞（n = 4个健康小鼠样品和5个患病小鼠样品），由RCA簇着色
3.1来自AIA小鼠模型的多细胞疾病模型（MCDM）
通过将每种细胞类型中差异表达的基因与所有其他细胞类型中预测的上游调节子相连接，基于scRNA-seq数据构建MCDM。像元类型大小对应于中心性得分。节点指示的数字表示已识别的特定类型的细胞数（例如，在RA关节中，我们已识别出4258个粒细胞）。一个从关节炎小鼠的淋巴结的MCDM。b来自关节炎关节的MCDM。c健康小鼠关节的多细胞模型（未显示淋巴结模型，因为只有一种预测的相互作用）。预测的上游调节子的基因名称显示在箭头上。Treg，T调节细胞。d 细胞类型的中心性评分与通过GWAS鉴定的具有遗传变异的基因的富集和差异表达基因之间专家管理的存储库之间的相关性（这些基因来自DisGeNet并基于人类基因的小鼠直向同源物进行了分析）
3.3疾病相关细胞类型的网络模型
a24个细胞类型和亚群均显著富集与RA相关GWAS富集后生标记。像元类型大小对应于关联-ln（p值）。b与类风湿关节炎（RA）相关的细胞类型的网络模型。节点对应于细胞类型，节点大小对应于关联的重要性（-log10 RA GWAS-表观遗传标记富集p值）。具有潜在空间相互作用的单元格类型被链接在一起，并且单元格类型的位置取决于中心得分，如背景中的圆环所示。C按与175种人类疾病的关联的重要性排序的细胞类型类别的条形图（Fisher结合了富含GWAS的表观遗传标记–为每种细胞类型类别计算的疾病关联p值）。d基于与b中相同的参数的与175种疾病相关的细胞类型的网络模型（有关详细信息，请参阅结果）
3.4根据13种疾病的临床概况研究，CD4 + T细胞具有诊断潜力。
疾病模块的玩具模型。疾病相关基因（红色）被映射到人蛋白质-蛋白质相互作用网络中的蛋白质（蓝色）上。共定位的疾病相关基因形成一个模块。b基于模块的分析概述。第一步是在前瞻性CD4 + T细胞微阵列研究中确定的13种疾病中的每一种的疾病模块的识别。对于每种疾病模块，基因将患者与健康对照区分开。为了成对比较疾病，将两个模块的结合中的基因分开患有不同疾病的患者。例如，流感和哮喘模块中的基因将流感患者与患有AUC为0.99的哮喘患者区分开，p = 3.3×10 -5，如c所示。c使用弹性网基于模块相交基因在13种疾病分类的曲线下面积（AUC）值上显示热图。d 基于在CD4 + T细胞中测得的预先选择的生物标志物（基因），对乳腺癌患者（n = 24）和健康受试者（n = 14）的分类准确性进行的独立验证研究。用弹性网进行分类，保留与原始研究相同的λ（λ）值。e – j根据在溃疡性结肠炎（UC）和克罗恩病（CD）模块相交处鉴定出的六种分泌血浆蛋白，对IBD患者进行潜在的诊断分类。这些蛋白质可以将患者与健康对照（HCs）分开。e CXCL11; f CCL25；g CXCL1; h CXCL8；i IL1B；Ĵ TNF。k克罗恩病和溃疡性结肠炎患者根据CXCL1和CXCL8的标准化蛋白质水平进行分类。UC，溃疡性结肠炎；CD，克罗恩病；HC，健康对照。星号表示p值<0.05。d – k方框中的条形图代表中位数，第25和第75个百分位数，而晶须延伸到± 2.7σ（请参见“方法”部分）
3.5苯扎贝特可预防抗原诱发的关节炎（AIA）
用苯扎贝特（n = 4）或模拟（AIA对照，n = 5）腹膜内（ip）治疗mBSA诱导的关节炎的雌性小鼠。一个基于在两个组的组织病理学第28天的关节炎严重性评分（H＆E染色，垂直条表示中值，使用曼-惠特尼评估组间差异的ü测试，* p <0.05）。b来自苯扎贝特治疗的小鼠的代表性H＆E联合图像。c从模拟（AIA对照，n = 5）或苯扎贝特治疗（n）分离的脾和淋巴结细胞中，CD4 +辅助性T细胞的抗原召回反应 = 4）小鼠；竖线表示平均值±SEM，使用双面Mann-Whitney U检验评估的组间差异* p <0.05）
##4总结和个人启发
4.1由于成千上万的基因参与了许多不同的细胞类型，因此了解复杂疾病中的致病机制和确定药物靶标是一项艰巨的挑战。诸如GWAS和scRNA-seq等无偏倚的全基因组方法表明，多种致病机制分散在许多细胞类型中。
4.2药物发现的困难以及为什么许多患者对治疗无反应。尽管如此，疾病相关细胞类型的系统表征和优先级以及用于诊断和治疗的机制仍未解决。一种明显的方法是识别并确定最重要的途径。在作者对AIA的scRNA-seq研究中，发现涉及T细胞分化的途径最为重要。这与对RA发病机理的当前理解是一致的，并已导致靶向此类途径的药物。但是，效果是可变的。作者对scRNA-seq数据的系统分析提出了一种可能的解释，该数据揭示了每种细胞类型中的大量其他途径和治疗靶标，以及细胞类型之间的重叠有限。
4.3结果支持基于网络的原理可以同时应用于两者。将来自AIA和人类RA的scRNA-seq数据整理成MCDM。取代任何具有明显关键调节作用的独特细胞类型或机制，MCDM中的大多数细胞类型都相互作用，形成了多向网络，其中多种细胞类型可能导致了发病机理。尽管一种细胞类型和机制可能发挥关键作用，但对遗传和表观遗传学数据的分析支持致病机制分散在多种细胞类型中。
4.4作者发现支持MCDM和网络原理可能具有优先考虑细胞类型以及生物标志物和药物发现机制的潜力。提供了所有提供的数据和方法以促进此类研究。
-----在读博士，代谢，组学研究 王平写作
5 #参考文献
Gawel, Danuta R et al. “A validated single-cell-based strategy to identify diagnostic and therapeutic targets in complex diseases.” Genome medicine vol. 11,1 47. 30 Jul. 2019, doi:10.1186/s13073-019-0657-3
