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GATK4 对于体细胞突变和生殖细胞突变的检测分别给出了对应的pipeline:
Germline SNPs+Indels
-
Somatic SNVs + Indels
本篇主要关注生殖细胞突变的分析流程Germline SNPs+Indels。示意图如下：
图中红色方框部分的从Analysis-Ready Bam 到，主要包括以下4步
HaplotyperCaller in GVCF mode
ImportGenomicsDB Consolidate GVCFs
GenotypeGVCFs
-
Filter Variants by Variabt Recalibration
官网给出了6套用于参考的pipeline
主要分析步骤都差不多，这里我选择第4个通用的流程 ，网址如下
https://github.com/gatk-workflows/gatk4-germline-snps-indels
1. HaplotyperCaller in GVCF mode
对于每个样本，采用HaplotyperCaller计算突变位点，命令如下
gatk --java-options "-Xmx6G -XX:GCTimeLimit=50 -XX:GCHeapFreeLimit=10" \
HaplotypeCaller \
-R ${ref_fasta} \
-I ${input_bam} \
-L ${interval_list} \
-O ${output_filename} \
-contamination 0 -ERC GVCFref_fasta代表参考基因组的fasta文件;input_bam代表预处理阶段产生的 bam文件；interval代表interval list文件，如果指定这个参数，只会输出指定区域的突变信息。对于全基因组测序，不需要这个参数，对于外显子和目的区域捕获测序, 则需要这个参数；output_filename代表每个样本输出的gvcf文件的名字。
2. ImportGenomicsDB Consolidate GVCFs
将所有样本的gvcf文件合并，产生一个总的gvcf文件，命令如下：
gatk --java-options -Xmx2G \
MergeVcfs \
--INPUT ${sep=' --INPUT ' input_vcfs} \
--OUTPUT ${output_filename}3. GenotypeGVCFs
包括两个步骤，第一步，导入MergeVcfs合并好的gvcf文件， 命令如下
gatk --java-options "-Xmx4g -Xms4g" \
GenomicsDBImport \
--genomicsdb-workspace-path ${workspace_dir_name} \
--batch-size ${batch_size} \
-L ${interval} \
--sample-name-map ${sample_name_map} \
--reader-threads 5 \
-ip 500workspace_dir_name代表输出目录;batch_size指定同时访问的最大文件数，默认值为0，表示同时访问所有样本的文件；interval代表interval list文件，如果指定这个参数，只会输出指定区域的突变信息。对于全基因组测序，不需要这个参数，对于外显子和目的区域捕获测序, 则需要这个参数；sampple_name_map是一个文件，记录了样本名称和每个样本对应的gvcf文件的路径。格式如下
sample1 sample1.vcf.gz
sample2 sample2.vcf.gz
sample3 sample3.vcf.gz
第二步， 运行GenotypeGVCFs，命令如下
gatk --java-options "-Xmx5g -Xms5g" \
GenotypeGVCFs \
-R ${ref_fasta} \
-O ${output_vcf_filename} \
-D ${dbsnp_vcf} \
-G StandardAnnotation \
--only-output-calls-starting-in-intervals \
--use-new-qual-calculator \
-V gendb://$WORKSPACE \
-L ${interval}需要注意-V 参数，指定的是GenomicsDBImport输出目录的路径。
4. Filter Variants by Variabt Recalibration
第一步，过滤vcf文件，条件为ExcessHet大于给定的阈值，命令如下：
gatk --java-options "-Xmx3g -Xms3g" \
VariantFiltration \
--filter-expression "ExcessHet > ${excess_het_threshold}" \
--filter-name ExcessHet \
-O ${variant_filtered_vcf_filename} \
-V ${vcf}excess_het_threshold指定ExcessHet的阈值；variant_filtered_vcf_filename代表输出的vcf文件的名字；vcf代表GenotypeGVCFs 生成的vcf文件的名字。注意，不满足条件的记录也会出现在最终生成的vcf文件中, 只不过对应的Filter字段的信息不是PASS。
第二步，删除vcf文件中的基因型信息，命令如下
gatk --java-options "-Xmx3g -Xms3g" \
MakeSitesOnlyVcf \
--INPUT ${variant_filtered_vcf_filename} \
--OUTPUT ${sites_only_vcf_filename}第三步，合并不同区间的vcf文件，并建立索引
gatk --java-options "-Xmx6g -Xms6g" \
GatherVcfsCloud \
--ignore-safety-checks \
--gather-type BLOCK \
--input ${inputs.list} \
--output ${output_vcf_name}
gatk --java-options "-Xmx6g -Xms6g" \
IndexFeatureFile \
--feature-file ${output_vcf_name}output_vcf_name代表输出的vcf文件；inputs.list指定不同区间的vcf文件的路径，格式如下
cohortA_chr1.vcf.gz
cohortA_chr2.vcf.gz
第四步，分别评估SNP和INDEL突变位点的质量, 命令如下
gatk --java-options "-Xmx24g -Xms24g" \
VariantRecalibrator \
-V ${sites_only_variant_filtered_vcf} \
-O ${recalibration_filename} \
--tranches-file ${tranches_filename} \
--trust-all-polymorphic \
-tranche ${sep=' -tranche ' recalibration_tranche_values} \
-an ${sep=' -an ' recalibration_annotation_values} \
-mode INDEL \
--max-gaussians 4 \
-resource mills,known=false,training=true,truth=true,prior=12:${mills_resource_vcf} \
-resource axiomPoly,known=false,training=true,truth=false,prior=10:${axiomPoly_resource_vcf} \
-resource dbsnp,known=true,training=false,truth=false,prior=2:${dbsnp_resource_vcf}
gatk --java-options "-Xmx100g -Xms100g" \
VariantRecalibrator \
-V ${sites_only_variant_filtered_vcf} \
-O ${recalibration_filename} \
--tranches-file ${tranches_filename} \
--trust-all-polymorphic \
-tranche ${sep=' -tranche ' recalibration_tranche_values} \
-an ${sep=' -an ' recalibration_annotation_values} \
-mode SNP \
--sample-every-Nth-variant ${downsampleFactor} \
--output-model ${model_report_filename} \
--max-gaussians 6 \
-resource hapmap,known=false,training=true,truth=true,prior=15:${hapmap_resource_vcf} \
-resource omni,known=false,training=true,truth=true,prior=12:${omni_resource_vcf} \
-resource 1000G,known=false,training=true,truth=false,prior=10:${one_thousand_genomes_resource_vcf} \
-resource dbsnp,known=true,training=false,truth=false,prior=7:${dbsnp_resource_vcf}resource指定建模时参考的vcf文件，可以看到对于indel和snp, 参考的数据库不一样。这一步只是建模，会输出一个recalibration table文件，用于ApplyVQSR命令。
第五步，运行VQSR, 命令如下
gatk --java-options "-Xmx5g -Xms5g" \
ApplyVQSR \
-O tmp.indel.recalibrated.vcf \
-V ${input_vcf} \
--recal-file ${indels_recalibration} \
--tranches-file ${indels_tranches} \
--truth-sensitivity-filter-level ${indel_filter_level} \
--create-output-variant-index true \
-mode INDEL
gatk_path --java-options "-Xmx5g -Xms5g" \
ApplyVQSR \
-O ${recalibrated_vcf_filename} \
-V tmp.indel.recalibrated.vcf \
--recal-file ${snps_recalibration} \
--tranches-file ${snps_tranches} \
--truth-sensitivity-filter-level ${snp_filter_level} \
--create-output-variant-index true \
-mode SNPinput_vcf文件为GatherVcfsCloud生成的vcf文件，先校正INDEL位点，后校正SNP位点。
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