思考题1：表观遗传学概念，分子机制，及表观遗传经典现象

一、概念：

在不改变DNA序列的前提下，所引起的可遗传的性状（基因表达）的变化。

二、分子机制：

1.DNA甲基化与去甲基化

2.组蛋白共价修饰

·组蛋白乙酰化和去乙酰化

·组蛋白甲基化和去甲基化

·组蛋白磷酸化

·组蛋白泛素化

3.组蛋白变体

4.非编码RNA调控

5.染色质重塑，需要ATP酶

三、表观遗传经典现象

1.花斑位置效应(Position-Effect Variegation)

最早在果蝇中发现了白里透红的表型，后来在酵母中发现了花斑表型，说明基因邻里关系到基因表达。

原因：当白眼基因位于常染色质，则表现为红颜；当白眼基因位于异染色质，则表现为白眼。

2.Poly comb沉默效应(Polycomb silencing)

正常的果蝇前腿有梳子，后腿没有，但是有些突变的果蝇，后腿也长出了梳子结构（poly comb）。

3.X染色体失活(X-chromosome Inactivation)

巴氏小体，一旦形成，可以在细胞分裂时被继承

4.基因组印记(Genomic Imprinting)

5.植物副突变(Paramutation in plant)

思考题2：在真核生物中，基因组DNA会压缩形成复杂的染色质结构，染色质结构及其生物学功能和作用机制？

一、染色质结构：

1.DNA和组蛋白

真核生物细胞中包含物种组蛋白：H1、H2A、H2B、H3、H4.

2.“串珠”形式的染色质——核小体

核小体：每个核小体由147 个碱基对的 DNA 缠绕在组蛋白八聚体1.75圈形成。核小体核心颗粒之间通过50bp左右的连接DNA相连。

3.四核小体结构

染色质结构中组蛋白H1与核小体以1:1的比例结合在一起，四核小体结构是染色质纤维动态折叠过程中的一个稳定的中间结构单元。

4.30纳米染色质纤维结构。

30nm染色质纤维是一个左手双螺旋结构，由“四核体结构”单元扭曲而成。基因转录过程中组蛋白分子伴侣FACT可以负调控“四核体结构”结构的稳定性，从而参与基因转录调控。

5.染色质纤维，核小体压缩成染色质纤维。

6.浓缩的染色质

二、染色质的功能

1.染色质作为DNA的载体，其结构的动态变化对基因转录沉默和激活过程以及DNA复制等生理过程必然非常重要，亦为表观遗传调控提供了一个重要的信息整合平台。

2.染色质的功能是将 DNA 高效包装成小体积，以适合进入细胞的细胞核，保护 DNA 结构和序列。

3.将 DNA 包装到染色质中可确保有丝分裂和减数分裂，防止染色体断裂，并控制基因表达和 DNA 复制。

三、作用机制

1.异染色质是染色质的紧密排列形式，可以沉默基因转录。异染色质构成端粒、中心周围区域和富含重复序列的区域。常染色质凝缩较少，含有活性最强的转录基因。

2.某些蛋白质，包括组蛋白、诸如转录因子等与染色质相互作用的蛋白质和 DNA 修复机制，在形成染色质结构中起作用。

3.染色质重塑复合物可以通过调节核小体和 DNA 之间的相互作用（通常是通过给组蛋白添加翻译后修饰）来改变染色质结构。

思考题3：哺乳动物与高等植物中DNA甲基化图谱分别如何建立？DNA甲基化的主要生物学作用？

高等动物和高等植物的DNA甲基化一般是5-甲基胞嘧啶（5mc）

一、高等动物

1.从头甲基化De novo methylation

传统的：DNMT3A、NNMT3A2、DNMT3B、DNMT3L（没有酶活催化活性）

新兴的：DNMT1

2.维持甲基化水平Maintenance methylation

DNMT1

3.生物学作用

1）转录沉默

2）保护基因组不被转座子转座

3）基因组印记

4）X失活

二、高等植物

1.DNA甲基化的建立：

DRM2

2.DNA甲基化的维持：

1）CG甲基化：MET1

2）CHG甲基化：CMT3

3）CHH甲基化： DRM2（最主要的）和CMT2（大的异染色质）

3.生物学作用

1）转录沉默

2）保护基因组不被转座

3）基因组印记

4）影响植物的正常发育

思考题4：组蛋白赖氨酸甲基化修饰和赖氨酸乙酰化修饰有哪些主要的区别？

1. 赖氨酸残基的侧链带正电荷；

2. 组蛋白尾巴上由赖氨酸残基携带的电荷（正点）与DNA（负电）会发生相互作用，使得彼此紧密互作，染色质致密；

3. 组蛋白赖氨酸甲基化不改变所带电荷，而乙酰化修饰改变了电荷状态，从带正点变为不带电；

4. 组蛋白赖氨酸甲基化不直接改变染色质结构，而乙酰化修饰因为中和了组蛋白的正点性，使得DNA和组蛋白形成的紧密结合打开，染色质变得更加松散，所以乙酰化常常和基因转录激活相关；

5. 为什么组蛋白赖氨酸甲基化，而不是乙酰化，具有很强的位点专一性？由识别蛋白对甲基化修饰的识别决定的

思考题5：染色质重塑因子的种类及其生物学功能和作用机制

一、四类ATP酶利用ATP水解产生的能量改变核小体核的结构。

1. SWI/SNF 家族

2.ISWI 家族

3.INO80/ SWR1家族

4.CHD 家族

二、生物学功能

1. SWI/SNF 家族

不同基因元件，带有不同的结构域，行使不同的生物学功能

①改变核小体的位置，增加调控蛋白的获取!

②改变核小体构象

③喷射（去除掉）组蛋白八聚物

④取代H2A、H2B二聚体

2.ISWI 家族

①和其他家族功能不同，最主要的功能是核小体移位后，测核小体之间的距离。

②参与一些基因的转录激活

③参与染色质组装

④参与异染色质形成

⑤在有丝分裂期间保持姐妹染色单体连结

3.INO80/ SWR1家族

1）INO80复合物：

①染色质组装；

②DNA修复；

③参与转录；

④与磷酸化的H2A.X相互作用；

⑤INO80复合物是将H2A.Z从染色质上弄下来，换上H2A。

2）SWR1复合物：

①SWR1复合物是将H2A.Z放到染色质上，将H2A摘下来；

②异染色质扩散的边界

③转录平衡启动子(与H3.3一起)

4.CHD 家族

将DNA的表观遗传修饰、核小体重塑和组蛋白修饰整合成一个连贯的调控方案。

5.染色质重塑复合体的共同特征

1）都可以结合核小体

2）DNA依赖的ATP水解酶

3）识别组蛋白修饰

4）ATP水解酶活性可以被调节

5）与其他蛋白质相互作用

三、作用机制

共性：要么使核小体发生滑动，或者组蛋白的替换，或者将核小体插入，或者将核小体去除。

1. 核小体滑动(cis-顺式位移):以ATP依赖的方式将组蛋白配体滑动到同一DNA分子上的其他位点。

2. 核小体移出(trans-反式位移):将组蛋白复合物转移到其他DNA分子上。

3. 核小体发生顺式或反式位移取决于Swi/Snf与八聚体的比例；

低Swi/Snf:八聚体比值（每200个核小体1个Swi/Snf复合物），则发生cis-顺式位移；

高Swi/Snf:八聚体比值（十倍的Swi/Snf:八聚体比），则发生trans-反式位移。

思考题6：miRNA和siRNA的比较；miRNA功能验证的方法

一、相同点

1.二者的结构类似

2.生物合成均需要Dicer蛋白

3.都是在RISC复合体中发挥功能

4.功能是类似的

二、差异点

1）miRNA

1. miRNA是基因组编码的，且miRNA基因由Pol II转录；

2. Drosha在细胞核中将pri-miRNA加工成pre-miRNA，且前体形成发夹结构；

3.调控其它基因的表达；

4.通常一个前体分子只产生一种miRNA；

5. miRNA被选择性地合并到RISC中进行目标识别；

6.miRNA与其靶mRNA存在不完全互补，从而抑制翻译。

2）siRNA

1.siRNA来源于外源的双链RNA或者由内源转录本在RNA指导的RNA聚合酶 (RdRP)作用下产生的双链RNA；

2.调控产生它的基因的活性（ta-siRNA 除外）；

3.通常一个前体分子产生多种siRNA；

4.将siRNA引导链整合到RISC中进行目标识别；

5. siRNA与其靶mRNA形成完美互补，并触发mRNA降解。

三、研究miRNA功能的方法

1.miRNA靶基因的预测与验证

2.miRNA敲除突变和过表达

3.下调miRNA活性: Short tandem target mimic (STTM)

4.表达不受miRNA调控的target (miRNA-resistant targets)

5.在全基因组水平鉴定植物miRNA切割靶基因mRNA的位点

思考题7：表观遗传信息的继承和遗传信息的继承在精度上有什么不同？有什么生物学意义？

一、继承的精度

1.遗传信息：高度稳定的，非可塑性的；

2.表观遗传信息：由可塑性和一定的可继承性；

3.表观遗传修饰继承不精确，不以严格的方式进行继承，变化的波动是可以容忍的。

二、生物学意义

1.一个基因组能够产生多种细胞类型 （分化，可塑性）

2.保障多细胞生物每一种细胞类型的相对稳定性 （一定的可继承性）

思考题8：研究蛋白质互作的技术方法

一、基于分子生物学的技术

1.酵母双杂交系统

原理：转录因子由两个结构域组成——DNA结合结构域和转录激活结构域，结合结构域可以结合在靶基因，激活结构独自也不能完成激活作用，构建两种融合蛋白共表达——DNA结合结构域+X蛋白，激活结构域+Y蛋白，如果X蛋白与Y蛋白相互作用，则可以将两个结构域结合在一起，实现其转录激活因子的功能，从而激活报告基因。

优点：容易做，应用面广，可以做大规模筛选，找新的相互作用，适合弱的和强的相互作用。

缺点：假阳性率高，必需看直接的相互作用，不适合做转录因子的相互作用，是一个100%的体外实验。

二、基于生物化学的技术

1.常规纯化（柱层析，色谱技术）

原理：一个稳定的蛋白质复合物的亚基通过常规色谱法相互协同纯化。最常用的色谱技术:离子交换，凝胶过滤，疏水相互作用。

优点：以分析为基础，适用于多亚基复合体，发现新的相互作用，色谱和质谱技术已经建立，技术手段成熟。

缺点：需要做很多工作，必须有一个好的活性测定体系，难以应用于瞬时相互作用，只能做稳定的相互作用。

2.亲和纯化

原理：一个稳定的蛋白质复合物的各个亚基紧密的结合在一起，不会散架，使用有特定亲和性的配体对其进行纯化，大大提高了纯化效率。

最常用的色谱技术：基于各种TAG的纯化、免疫亲和纯化。

优点：高效，对于多亚基复合体效果好，适合用来找新的相互作用，技术手段成熟。

缺点：内源性靶点很难获得好的抗体，难以应用于瞬时相互作用，可能会出现常见的非特异性交互作用。

3.Co-IP & pull down

原理：类似于亲和净化，关键区别在于洗涤条件温和，洗的盐浓度很低。

最常用的技术:Co-IP，GST pull down，peptide pull down

优点：容易，非常适合验证预测的相互作用，适用做弱的、瞬时的相互作用。

缺点：错误率高，不能用来寻找新的相互作用。

4. SILAC辅助的亲和纯化（稳定同位素标记）

原理：SILAC提供了两个样品中相同蛋白质的相对定量。

优点：专门为弱相互作用而设计，对于多亚基复合体很好，用来找新的相互作用。

缺点：同样会发生假阳性和假阴性，对于蛋白质的相对定量是一个正在发展中的技术，昂贵。

5.临近标记后亲和纯化

原理：用生物素对与目标蛋白相关的蛋白质进行共价标记，然后进行亲和纯化

常用技术有：BioID，APEX，PUP-IT等

优点：专门为弱相互作用而设计，对于多亚基复合体很好，用来找新的相互作用，是一个in vivo体内实验。

缺点：同样会发生假阳性，是一个新技术，许多方法正在改进中。

三、基于荧光的技术

1.免疫共定位

原理：使用荧光标记抗体检测目标蛋白，合并两幅或多幅图像，检测是否定位在一起。

优点：是一个in vivo体内实验；能够看到；有广泛的应用，直接和间接的相互作用，稳定的和不稳定的相互作用都可以检测。

缺点：需要特定的抗体，不适合用于发现新的相互作用。

2.双分子荧光互补法（BiFC）

原理：GFP、YFP等可以分为两个结构域，如果这两个结构域相遇，它们就会折叠成一个功能分子，恢复荧光。

优点：简单，in vivo，活细胞；能够看到；有广泛的应用，强的弱的相互作用都能做。

缺点：只能做直接的相互作用，不适合用于发现新的相互作用，需要过表达。

3.荧光共振能量转移(FRET)

原理：荧光团可以被给定波长的光激发，并发出特定波长的另一种光。一个被激发的荧光团(供体)可以将其能量转移到另一个近位置(<10nm)的荧光团(受体)并激发该受体。

优点：in vivo，活细胞；可以做稳定的或弱的相互作用。

缺点：不适合用于发现新的相互作用，需要过表达。

四、基于生物物理学基础的技术

1.表面等离子体偏振(SPR)

原理： 表面涂有一个蛋白，第二个蛋白流通过流通道流入，如果发生相互作用，反射光的信号将发生变化

优点： 定量的实验，稳定相互作用和弱的相互作用都适合。

缺点： 只能做直接的的相互作用，样品的纯度很重要，批次之间的差异较大，需要特殊仪器。

2.等温滴定量热法(ITC)

原理： 参照池和样品池通过加热器保持相同的温度，将样品放在样品池中，滴定加入配体，吸收或释放的热量被检测。

优点：定量的实验，稳定相互作用和弱的相互作用都适合。

缺点：只能做直接的的相互作用，样品的纯度很重要，需要特殊仪器，缓冲液要除气以避免气泡。

3.分析离心

原理： 一种超离心系统，它有一个可以用光实时监测的观察单元，根据吸光度可以计算出蛋白质浓度，对于已知的蛋白质大小，通过计算可以预测平衡曲线。

优点：定量的实验，稳定相互作用和弱的相互作用都适合，可以提供精确的成分信息，可以进行多波长和荧光检测。

缺点：检测直接相互作用，样品纯度非常重要，相对较大的批间差异，需要特殊设备。

思考题9：染色质免疫共沉淀技术(ChIP)的原理是什么？用该技术能解决什么科学问题？如何判定ChIP实验是否成功？

一、原理

1.先用甲醛处理，交联蛋白质到DNA ；

2.进行超声处理，打碎染色质，打碎成一个一个的核小体；

3.使用抗体孵育；

4.分离抗体/染色质复合物

5.从复合物中分离纯化DNA

6. PCR分析

二、解决的问题

ChIP可用于研究组蛋白的共价修饰状态和转录因子所结合的 DNA。

ChIP是研究DNA和蛋白质互作的一个方法，它可以研究组蛋白修饰，乙酰化、泛素化、甲基化等，也可以研究转录因子的作用结合位点。

三、如何判定

要进行一个好的质量控制，用PCR的方法检测是否成功了。

寻找一个染色质状态不一样的actin（常染色质）作为内参，目的基因（异染色质）片段稍微大一点（但不能差很多，因为大片段的扩增效率底，很难得到好的结果），在一个PCR管内做这个实验，

1.先用水做负对照，在这种情况下PCR什么都扩不出来；

2.使用提出来的纯DNA作为模板，然后放在一起做PCR时，两条相同亮度的条带，这样才能保证actin和目的基因为1:1，这样可以避免实验误差；

3.做不加抗体和不交联的两组负对照，这两种负对照都是抓不到想要的东西，目的是探索扩增合适的循环数，循环数太少，产物出不来；循环数太多，都像input一样。

4.最后使用专门的抗体交联后得到的DNA做PCR，在同一个管里做状态不一样的染色质有明显的差别，这才证明试验成功了。

思考题10：转座子(Transposon)或转座元件 (Transposable Element, TE) 的功能

一、转座子：

1. Barbara McClintock首次在玉米中发现；

2.基因组上可以移动的DNA片段，在动植物中广泛存在；

3.转座子的转座是基因组进化的主要驱动力；

4.转座子的沉默保证了基因组的稳定性，异常跳跃导致多种疾病，宿主基因组已经进化出多种机制来限制有害物质的迁移；

5.转座子是表观遗传调控的重要靶点，处于不同染色质微环境的转座子被不同的表观遗传机制所调控；

6.负责大规模染色体重排和单基因突变事件。

二、转座元件

1.转座元件转座可以产生新基因；

2.转座元件转座可以产生天然的遗传多样性；

3.转座元件转座可以改变基因表达模式；

4.转座元件影响植物的发育；

5.TE插入突变导致植物表型改变。

思考题11：请简要概述三维基因组研究领域的最新进展 （各个层次的染色质结构及其研究方法）及其展望。

三维基因组包含各个层次的染色质高级结构：

1.核小体定位（Mnase-seq）；

2.30nm染色质纤维（Micro-seq,

RICC-seq, chrom-EMT）；

3.启动子与调控区域的开放染色质区域（Open chromatin regions）（DNase-seq, ATAC-seq, MNase-seq, FAIRE-seq）；

4.染色质远程相互作用形成的染色质环结构（chromatin looping）（3C-, 4C-, FISH成像）；

5.染色质-染色质相互作用形成的染色质拓扑结构域（topology associated domain,

TAD）（Hi-C, ChIA-PET, FISH成像）；

6.染色质-核结构相互作用形成的染色质区域(compartment or domain)，包括compartment A/B以及与核膜/核纤层相互作用的异染色质区域（Lamina-associated domain,

LAD）（DamID, ChEC, ChIC）；

7.染色体在细胞核内的定位与疆域（chromosome territories）（FISH, Hi-C）。