文献信息
标题：Plasmon-Enhanced Single Extracellular Vesicle Analysis for Cholangiocarcinoma Diagnosis
日期及杂志：25 January 2023, Advanced Science
作者及单位：Mi Ho Jeong, Department of Internal Medicine
文献概述(这篇文献的结论是什么？)
胆管癌(Cholangiocarcinoma, CCA)是一种致命的疾病，经常发现在晚期不可切除的阶段。目前，还没有有效的诊断方法或生物标志物能够高可信度地早期检测到CCA。分析从液体活检中获得的肿瘤来源的细胞外囊泡(tumor-derived extracellular vesicles, tEVs)可以为实现这一目标提供新的机会。本文报道了一种先进的纳米等离子体传感技术，称为FLEX(荧光扩增细胞外囊泡传感技术)，用于灵敏和稳健的单EV分析。在FLEX实验中，EV被捕获在等离子体金纳米孔表面，并用癌症相关生物标志物进行免疫标记，以识别EV。然后，等离子体金纳米孔结构放大EV的荧光信号，这是一个单个EV水平有效的放大过程。FLEX EV分析揭示了tEV及其标记水平的广泛异质性。由于信号微弱，FLEX还可以检测到传统EV荧光成像无法检测到的小tEV。肿瘤标志物(MUC1、EGFR和EPCAM)在CCA中被鉴定出来，并应用该标志物组合检测临床胆汁样本中的tEV。FLEX法检测CCA的AUC为0.93，明显优于目前的临床指标。灵敏、准确的纳米等离子体EV传感技术有助于CCA的早期诊断。
文献结果(每个结果的图片详细解读)
1、等离子体增强单EV分析的FLEX技术
FLEX技术的一个关键概念是能够放大单个EV的信号，以便在罕见的tEV中检测到稀缺的生物标志物。(图1A)在4英寸硅晶圆上制造的FLEX金纳米孔芯片。制造的晶圆被切成1平方厘米的芯片用于EV分析。(图1B) FLEX芯片的扫描电子显微图显示了周期性金纳米孔结构。(图1C)时域有限差分(FDTD)模拟显示了被限制在金纳米井表面附近的增强电磁场。增强场负责等离子体增强荧光放大。(图1D) FDTD模拟(蓝色虚线)和实验测量(红色实线)得到的直径为200nm、周期为500nm的金纳米阱阵列的反射光谱。(图1E)与普通玻璃基板相比，FLEX芯片上AF488、AF555和AF647荧光团的荧光信号增强。在金纳米孔和玻璃表面形成了一层薄薄的聚乙烯醇(PVA)层，其中包含荧光染料，如插图中的原理图所示。数据以三次重复测量的平均值±标准差显示。(图1F)在金纳米孔表面捕获的EV的代表性示意图。金表面被聚乙二醇(PEG)层功能化以捕获EV。用一抗(1°)标记捕获EV，然后用荧光基团偶联的二抗(2°)标记EV。(图1G)在FLEX和纯金底物上捕获的荧光标记ev的代表性荧光图像。对于相同的样品，FLEX芯片捕获的EV产生更强的荧光强度。
接下来，本研究表征了等离子体在不同荧光通道中的增强，用于多路EV分析。(图2A)在FLEX和普通Au衬底上捕获的EV的代表性荧光图像。分别用AF488、AF555、AF647和Cy7荧光团对EV进行荧光标记，并使用相同的PEG连接剂在金表面捕获相同数量的EV。(图2B)基于荧光强度的检测到的EV计数直方图。彩色条表示在FLEX芯片上捕获的EV，灰色条表示在普通Au基板上捕获的EV。(图2C,D)使用FLEX和普通Au底物检测到的EV的数量和荧光强度。分别用AF488、AF555、AF647和Cy7荧光团对EV进行荧光标记，数据以三次重复测量的平均值±标准差显示。结果表明，在没有信号增强的情况下，使用普通衬底的传统荧光成像只能检测到总EV的10-15%。
2、CCA来源EV的单EV分析
(图3A)具有代表性的SNU308 EV双通道荧光图像。所有捕获的EV都用AF555(绿色)标记，用抗EpCAM抗体和AF647二抗(红色)免疫标记检测EpCAM。(图3B) AF555(绿色)和AF647(红色)通道沿(A)白色虚线的荧光强度谱。AF555代表EV信号，AF647代表EpCAM信号。(图3C-F)来自SNU308细胞系的EV二维散射图。x轴和y轴分别代表AF555(通用EV染色)和AF647(癌症生物标志物)强度。当AF555和AF647强度同时存在时，对EV进行计数。右侧的图表示EpCAM、MUC1、EGFR和IgG(同型对照)的共定位比率。标记阈值沿y轴虚线定义为IgG信号的平均值+ 3 ×标准差。
(图4A,B) CCA (EpCAM, MUC1和EGFR)和EV (CD63)标记通过单个EV分析(FLEX)和批量EV分析(bead-based flow cytometry)对来自三种不同CCA细胞系和一种正常细胞系的EV进行分析。(图4C) FLEX和批量EV分析之间每个标记的z-score的相关性。Pearson相关系数r = 0.91 (P < 0.0001)。(图4D) FLEX和批量EV分析检测灵敏度的比较。相同体积(30µl)的等分样品用于直接比较。检测限是通过滴定已知EV量和测量它们的CD63信号来确定的。数据显示为重复测量的平均值±标准偏差。
3、CCA诊断中临床样品的EV分析
(图5A)人胆汁样本中EV的分离。本文测试了超离(UC)、排阻色谱(SEC)及其UC+SEC联合分离EV的方法。(图5B) CD63阳性EV计数比较。使用(图5A)中描述的方法从三个患者胆汁样本中分离出EV。SEC方法显示所有三个样本中CD63阳性EV计数最高。数据显示为四次测量的平均值±标准差。(图5C)分析17例CCA患者和8例良性患者的胆汁来源EVs，选择CCA标志物(EpCAM、MU1和EGFR)。IgG同型为阴性对照。来自每个标记的FLEX信号在对数刻度的热图中表示。(图5D)每个tEV标志物(EpCAM、MUC1和EGFR)及其组合(EVCCA)上的FLEX信号，在17例CCA和8例良性患者的胆汁源性EV中测量。Mann-Whitney unpaired t检验(** P < 0.01， *** P < 0.001)。(图5E)各tEV标记物、强度及EVCCA的受者工作特性曲线。EVCCA特征曲线下面积(AUC)最高，为0.93。
文献方法(使用的生物信息学方法)
数据分析
使用GraphPad Prism version 9 分析数据。所有数据均以均数±标准差表示。Mann-Whitney unpaired t检验用于比较两个独立的组。对于两组以上的比较，采用单因素方差分析。以p < 0.05为差异有统计学意义。
文章亮点(这篇文献的优点在哪？)
FLEX能够通过纳米等离子体感应技术放大单个细胞外囊泡的信号，从而能够检测到稀有生物标志物。在实验中，使用FLEX芯片作为底物可以显著提高细胞外囊泡的检测灵敏度，而无需额外的放大过程或专门的仪器。
FLEX还可以进行多通道的细胞外囊泡分析，能够同时检测多个荧光信号。
我的疑问(这篇文献的不足在哪？)
虽然文章提到了FLEX技术的名称和基本原理，但关于该技术的详细原理仍不是很清晰
本文对有关结果的解释和说明相对较少
文章缺乏对类似技术及方法的比较和讨论
和我相关(我从这篇文献里学到了什么？)
- 本文主要介绍了一种名为FLEX（荧光增强的细胞外囊泡传感技术）的纳米等离子体增强单个细胞外囊泡分析技术。本文的重要性在于提出了一种新的技术方法，可以帮助早期诊断CCA。通过分析液体活检中的tEVs，该技术可以提供一种非侵入性的诊断方法，并且具有较高的准确性和敏感性。
