来源：https://www.biomart.cn/experiment/430/457/741/43993.htm

一,限制性内切酶(Endonucleosase)

(一)限制性内切酶(Endonucleosase)的发现与分类

1) 50年代初发现细菌能将外来DNA片段在某些专一位点上切断,从而保证其不为外来噬菌体所感染,而其自身的染色体DNA由于被一种特殊的酶所修饰而得以保护,这种现象叫做限制-修饰,它们由三个基因位点所控制:hsd R, hsd M, hsd S, 十年后,人们搞清了细菌的限制与修饰分子机理:

hsd R---限制性内切酶

hsd M---限制性甲基化酶

hsd S---控制两个系统的表达

1968年Smith等人从流感嗜血杆菌株中分离出两个类内切酶,Hind II和Hind III,为基因工程技术的诞生奠定了基础.

截止到目前为止,已经分离出400余种II类酶,搞清识别位点的有300种,商品化的约有一百种,而实验室常用的有二十种 .

2)限制性核酸内切酶可分为三大类:

I类 能识别专一的核苷酸顺序,并在识别点附近切割双链,但切割序列没有专一性.

II类 识别位点(回文序列)严格专一,并在识别位点内将双链切断

III类 识别位点严格专一(不是回文序列),但切点不专一,往往不在识别位点内部.

因此在基因工程中具有实用价值的是II类限制性内切酶.

(二)II类限制性内切酶的命名及特性

命名原则:取属名的第一个字母大写,取种名的前两个字母小写,构成基本名称.该种中发现的不同的酶按照顺序编号I, II, III等.如存在变种和品系,取变种或品系的一个字母.若酶存在于质粒上,则需大写字母表示非染色体遗传因子.

如,HindIII从Haemophilus Influenzue d株中分离的第三个酶.EcoRI表示基因位于Escherichia coli中的抗药性R质粒上.

(三)II类限制性内切酶的底物识别顺序及切割位点

绝大多数的II类限制性内切酶在底物DNA上的识别顺序长度为4,5,6碱基对,这些碱基对的顺序呈回文结构(Palindromic),而且切点就在其内部,如EcoRI 5'-GAATTC-3' .

DNA被限制性内切酶切开之后,呈现两种断口:

钝端(平端)如Pvu II, Alu I, EcoR V等

粘端(粘性末端)如:EcoR I等

图2-1 限制性内切酶产生的末端

(四)识别位点在DNA分子中的频率

对于特定的限制性酶在DNA分子中的识别位点数目是可以计算的,四碱基的酶平均大约每256个核苷酸(44)有一个识别位点,而六碱基的酶大约4096(46)个核苷酸有一个识别序列,计算是在假定核苷酸随机排列的情况下进行的.实践中这种方法不完全正确,如λ DNA长49kb,对于六碱基的酶应该有12个切割位点,实际上要少一些,如Bgl II只有6个,BamHI只有5个,而SalI只有2个.

二,甲基化酶

在专一位点上甲基化,与限制性内切酶相对应.

(一)大肠杆菌中的甲基化酶

dam甲基化酶: 可在5'GATC3'序列中的腺嘌呤N6位置上引入甲基,这样可使一些识别顺序中含有5'GATC3'的限制性内切酶不能切割来自大肠杆菌的DNA如Bcl I(TGATCA),但BamH I(GGATAA)则不会因为N6A的甲基化而失去活性,因为这两种酶对底物的特异性不同.

dcm甲基化酶 此酶在序列5'CCAGG3'或5'CCTGG3'中的胞嘧啶C5上引入甲基,受其影响的限制性内切酶是EcoR II.

(二) 甲基化酶在基因工程中用途

许多II类限制性内切酶,都存在着相对的甲基化酶,它们可修饰限制酶识别顺序中的第三位腺嘌呤上,封闭酶切位点,从而使其免受切割.如:M.EcoRI催化s-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)的甲基转移到EcoRI识别顺序中的第三位腺嘌呤上,从而使DNA免受EcoRI的切割.

三,T4-DNA连接酶(T4-DNA Ligase)

来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌,连接修复3'端羟基和5'端磷酸基因,脱水形成3'-5'磷酸二酯键

连接双链DNA上的单链缺口(Nick),因此亦可连接限制内切酶所产生的粘性末端

连接RNA模板上的DNA链缺口

连接平头双链DNA速度很慢,在高浓度的底物和酶的作用下方可进行,这属于分子之间的连接.

四,核酸酶

作用: 降解磷酸二酯键

分为:外切酶 内切酶

(一) Bal 31(来自于细菌Alteromonas espejiana) 单链特异的核酸内切酶活性,双链特异的内切酶活性.依赖于Ca2+

用途:

构建限制酶图谱

产生末端缺失突变

DNA超螺旋线性化

(二)E. coli外切酶III

只降解DNA分子的一条链,产生单链的DNA分子.

(三)S1核酸酶(来源于米曲霉菌)

特性:

1. 降解单链DNA或RNA,降解DNA的速度大于降解的速度

2. 降解发生的方式为内切和外切

3. 酶切活性需4.0-4.5pH环境,Zn2+激活

4. 酶量过大时会降解双链核酸,因为双链降解活性比单链低75000倍

(四) DNase I: 来自于牛胰腺, 既可以降解单链也可以降解双链,没有特异性,产生单核苷酸或短链

五,聚合酶

(一)DNA聚合酶I

5'-3'聚合酶活性

3'-5'外切酶活性

5'-3'外切酶活性

核酸内切酶活性

可以被枯草杆菌蛋白酶水解成:Klenow片段和N端具5'-3'外切酶活性的分子.

(二) Klenow酶

该酶无5'-3'外切活性,保留了5'-3'聚合活性及3'-5'外切活性,基因工程中利用该酶:

修复限制性内切酶造成的5'突出的粘性末端

标记DNA探针

催化cDNA第二条链的合成

末端终止法测序

图2-4 Klenow 酶的作用方式

(三) T4 DNA聚合酶

与Klenow酶相似,外切酶活性更高.体外诱变反应中效率很高.

(四)T7 DNA聚合酶

测序酶

(五) Taq DNA聚合酶

耐高温,主要用于PCR反应.

(六) 逆转录酶:将mRNA转录成cDNA

AMV逆转录酶(鸟类成髓细胞性白血病病毒)

DNA聚合酶活性

RNase H活性

DNA内切酶活性

核酸结合活性

M-MLV逆转录酶(Moloney鼠白血病病毒)

两种逆转录酶的区别

肽链的组成

禽酶2条肽链,具聚合酶和很强的RNase H活性

鼠酶1条,较弱的RNase H活性

反应的最适温度

禽酶42°C,二级结构丰富RNA,禽酶效率高

反应的最适pH值

禽酶pH 8.3

鼠酶pH 7.6

六,DNA修饰酶

有大量的修饰酶,主要的有以下几种:

1) 碱性磷酸酯酶(来自于大肠杆菌或小牛肠道)可以去掉DNA分子的5'端的磷酸基团.

2) polynucleotide kinase: 来自于T4侵染的大肠杆菌,在5'端增加磷酸基团.

3) 末端脱氧核苷酸转移酶(terminal deoxynucleotidyl tansferase) 来自于小牛胸腺组织,在DNA分子的3'端增加一个或多个脱氧核苷酸.

4) Topoisomerase改变共价闭合双链DNA分子的结构

第二节 DNA的切割反应

一,缓冲系统的组成

II类酶的酶活条件:Tris-HCl PH7.5, 25-50mM;10mM MgCl2 ;NaCl 0-150mM; DTT 1mM

根据不同酶对盐离子要求不同,可将缓冲液分为以下三种情况:

高盐:100-150mM

中盐:50-100mM

低盐:0-50mM

二,酶切操作

DNA量的确定,加入酶量的确定,发应体积的确定(20μl),反应时间的确定,1-1.5hr,一般为37℃,但也有例外,如Taq I在65°C时活性最高.

单位限制性内切酶定义为:在最佳缓冲系统和20μl体积中反应1小时,完全水解1μgDNA所需的酶量.

三,酶切结果分析

(一) 酶切片段的检测

1) 通过凝胶电泳分离,根据分子量分离.根据凝胶的浓度可以分离不同分子量的片段,聚丙烯酰胺凝胶电泳可以分离1-300bp的分子.

2) DNA分子的检测 a. 染色EB,DNA分子小于25ng,很难检测到

b. 放射性自显影, 可以监测少到2ng DNA分子.

(二)估计DNA分子的大小

根据DNA分子的迁移率,可以用公式计算出分子量D=a-b(logM)

D是移动的距离,M是分子量,a, b是恒量但随着电泳条件的改变而改变.

也可以根据已知大小的片段进行比较,误差约在5%左右.

四,多酶联合酶解

对于对浓度要求相同的酶,原则上可以同时酶解;

对于对浓度要求不同的酶,可以:

1. 低盐浓度的酶先切,后补加NaCL

2. 一种酶切后,换缓冲液,加5mM NaAc 0.1体积,2体积乙醇,冰浴5min,4℃离心10min,干燥

五,定位酶切位点

建立酶切图谱需要一系列的酶.

首先确定每一种酶切后产生的分子量和片段的数目;

然后进行双酶切;

比较酶切和双酶切的结果,绘制酶切图谱;

含糊的位点可以通过部分酶切解决,可以短时间的酶切或者在4°C条件下进行.

六, 限制性内切酶的star活性

在PH不合适,或甘油浓度过高≥10%时,限制性内切酶的切割位点会出现非专一性,因此应确保酶的体积为总体积的十分之一以下.

第三节 DNA片段的连接

重组DNA分子构建的最后一步是连接,通过连接酶完成.相对而言,钝端的连接效率较低,因此一般提高DNA浓度的方法增加接触的机会.而粘性末端的连接效率较高,因为两个粘性末端可以通过氢键碱基互补配对.这种暂时的,碱基配对结构可以提高连接的效率.在分子克隆的连接方式主要有以下几种:

一,连接方式

(一)相同粘性末端的连接

来源:

相同的酶

同尾酶

问题:

极性有两种可能

同尾酶连接后,不能用任何一种酶酶切.称为"焊死".

(二)平头末端的连接

粘性末端--分子内部连接,平头末端--分子间的连接.

提高连接效率的方法:

加大酶用量(10倍)

加大平头末端底物的浓度

加入10%PEG(8000),促进分子间的有效作用

加入单价阳离子, 150-200mM NaCl

提高反应温度

平头连接同样存在两种极性

(三)不同粘性末端的连接

突出5'末端

Klenow补平,或S1核酸酶切平,然后平头连接

突出3'末端

T4-DNApol切平,然后平头连接

突出末端不同

Klenow补平,或S1核酸酶切平

连接后,可能恢复限制性位点,甚至还可能产生新的位点.XbaI与HindIII( XbaI恢复), XbaI与EcoRI(均保留),BamHI与Bgl II(产生ClaI位点)

(四)人工粘性末端的连接

5'突出的末端

外源片段先用Klenow补平;然后用TdT补加polyC;载体片段也用Klenow补平,加polyG,退火不经连接即可转化.目的是:不使酶切位点遭受破坏.

3'突出的末端

外源片段先用TdT加polyG;载体片段加polyC;然后退火;再用Klenow补齐;连接

平头末端

可直接用TdT补加末端,但以加polyA/T为佳.这样稍微加热,AT区就会出现单链区域,然后用S1核酸酶水解即可回收片段

(五)粘端与平端的连接

linker : 人工合成的,含有限制性内切酶识别序列的,短的双链DNA片段.

– 连接的效率较高

– 酶切时可能破坏DNA分子的完整.

adaptor:人工合成的,具有粘性末端寡聚核苷酸.

(六)粘性末端的更换

在DNA片段上某一酶切口处换成另一种酶切口

– BamHI酶切片段用Klenow补平,或用S1酶切平;连接一段linker或Adaptor,使之产生EcoRI粘性末端.这样BamHI切口就换成了EcoRI切口 .

– 由AluI更换EcoRI:AluI切开,T4-DNApol切平,另一段DNA EcoRI切开,Klenow补平,连接,原来含有AluI的片段变成含有EcoRI

二,重组率

重组率:连接反应结束后,含有外源DNA片段的重组分子数与加入的载体分子数之比.较为理想的重组率为25-75%

提高重组率的方法:

连接反应条件 外源片段:载体=2:1-10:1(分子数),增加碰撞机会,减少自身环化.

载体除磷 (磷酸酯酶5'除磷).

TdT在3'端增加人工粘性末端,防止载体自我环化

(责任编辑：大汉昆仑王)