在前面两篇文章中，我们着重介绍了 Cell Ranger 进行基因比对的理论模型以及如何识别高质量细胞算法，这两部分是基础，正所谓温故而知新，大家可以点击如下链接进行复习：
Cell Ranger 知多少？（上）（点击链接了解详情）
Cell Ranger 知多少？（中）（点击链接了解详情）
在掌握了基础后，让我们来高屋建瓴，继续深造吧！
本文将着重从两部分介绍 Cell Ranger，一部分为细胞和基因定量的 cellranger count 的使用方法及结果解读，另一部分是整合分析的 cellranger aggr 的使用方法及结果解读。
以最新版本 Cell Ranger v5.0 示例：
cellranger count 的使用方法
cellranger count \
--id=样本名 \ # 数据结果文件夹的名称
--transcriptome=参考基因组文件目录路径 \
--fastqs=原始文件路径 \
--sample=样本名 \ # 原始下机数据文件的前缀
--description=HT2021-xxxx_人-肺癌 \ # 对样本信息进行描述
--localcores=16 \ # 将限制 cellranger 一次最多使用 16 个核
--localmem=64 \ # 将限制 cellranger 使用的最大内存量 64（GB）
需要说明的是：
1. 原始下机的数据命名可能不满足命令的要求，需要对 FASTQ 文件名进行重命名。【原始数据命名规则：SampleName_S1_L001_R1_001.fastq.gz (and the R2 version)】 --sample=指定样本名。如有多个原始数据，指定文件名称中相同的样本名即可，例如下图指定为 A。
2. 如遇到 cellranger 无法识别 library 的报错，可参考下列参数指定建库方式：
3. 如果遇到结果不符合预期，可根据情况利用 --force-cells=Num 指定细胞数，通过调整细胞数以获得预期的结果。
4. 如果是裂核项目，需加上 --include-introns 参数运行。因为添加此参数可以将 reads 映射到内含子区域，提高对含有大量前 mRNA 分子（如细胞核）样品的敏感性。
5. 该命令完成后将输出创建一个名为 sample ID 的新文件夹。如果此文件夹已经存在，cellranger 将假定它是一个现有的 Pipe Instance 并尝试继续运行它，如果命令中断或者意外失败，请务必删除该结果文件夹后重新运行。
cellranger count 的结果解读
通过 cellranger count 定量生成的结果很多，其中 outs 子文件夹中的文件是最重要的，下面我们一起来看看。
Output Files:
outs
├── analysis # 数据分析
│ ├── clustering # 聚类文件夹，图聚类，k-means 聚类
│ ├── diffexp # 差异分析
│ ├── pca # pca 线性降维
│ ├── tsne # tsne 非线性降维
│ └── umap # umap 非线性降维
├── cloupe.cloupe # 用于 Loupe Browser 可视化和分析文件
├── filtered_feature_bc_matrix # 过滤后的 barcode 矩阵信息，用于后续分析的必要文件│ ├── barcodes.tsv.gz
│ ├── features.tsv.gz
│ └── matrix.mtx.gz
├── filtered_feature_bc_matrix.h5 # 过滤后的 barcode 信息 HDF5 格式
├── metrics_summary.csv # 结果汇总 csv 文件
├── molecule_info.h5 # UMI 信息，cellranger aggr aggregate 数据的时候会用到的文件
├── possorted_genome_bam.bam # 比对到参考基因组和转录本上并带有 barcode 信息的 reads 信息
├── possorted_genome_bam.bam.bai # possorted_genome_bam.bam 的索引文件├── raw_feature_bc_matrix # 未经过滤的所有 barcode 的矩阵信息
│ ├── barcodes.tsv.gz
│ ├── features.tsv.gz
│ └── matrix.mtx.gz
├── raw_feature_bc_matrix.h5 # 原始 barcode 信息 HDF5 格式
└── web_summary.html # 结果汇总 html 文件及可视化
其中 web_summary.html 网页版报告对结果进行汇总并进行可视化：分为 Summary 和 Analysis 两个部分。
Summary 部分包含如下几个部分：
- 异常结果警示或报错
如果数据有指标异常，则在报告的顶端出现黄色 warning 信息或者红色 error 信息，如下图所示，“1 warnning”表示 Fraction Reads in Cells 低，理想值是大于 70%，而实际只有 58.3%。
- 代表性指标和测序质量
对样本中的细胞和表达的基因数评估，同时给出了测序获得的总的双端 reads 数、有效 barcodes百分比、有效 UMI 百分比、测序饱和度以及各种 Q30 百分比信息。如下图所示：
- 比对质量
统计 reads 比对到参考基因组中的百分比，同时给出唯一比对到参考基因组中的 reads 百分比、唯一比对到基因间区、内含子区、外显子区、转录本区的 reads 百分比等。
- 细胞质量
Barcode Rank Plot 通过 barcodes 上的 UMI 分布来对应细胞数目，深蓝色代表高质量细胞，灰色代表背景。图中部分区域颜色为浅蓝色，这是由于该处部分细胞是背景细胞，部分细胞是高质量细胞，即蓝色的深浅代表局部高质量细胞的比例。这是因为 barcode 不是严格根据其 UMI counts 值确定为高质量细胞，而是由其表达谱确定【可点击链接“cellranger知多少（中）”，了解详情】。同时给出细胞中有效 reads 比例、检测到的总的基因数以及每个细胞中 UMI 数的中位值。如下图所示：
- 样本信息
有关样本分析的基本信息: 样本名，样本描述，文库类型，是否包含内含子，参考基因组信息，cellranger 版本信息等。
关于 Summary 中几个关键的术语说明：
Analysis 部分结果展示如下：
- t-SNE 图
a.细胞表达量分布的 t-SNE 图（如下左图）
这里展示的是每个细胞 barcode 的总 UMI counts 值，UMI 标签用于标识转录本，UMI 的 counts 值则可表示转录本的表达量，采用 t-SNE 降维算法，对细胞的表达量进行可视化，每个点代表一个细胞，在这个空间中，相互靠近的成对细胞的基因表达谱比相互远离的细胞的基因表达谱更为相似。
b.细胞亚群分布的 t-SNE 图（如下右图）
根据表达量对细胞进行聚类，从而识别细胞亚型，提供了两种聚类算法 Graph-based 和 K-means。通过右上角的下拉按钮，可以查看不同的聚类结果，根据聚类结果不同亚群的细胞用不同颜色表示。
- 基因差异表达分析
差异表达分析旨在为每个亚群找到在该亚群中相对于样本其余亚群表达更高的基因。这里对每个基因在每个亚群和样本其余亚群之间进行差异表达测试。表头的具体含义可点击右侧 ？ 进行了解。
- 测序饱和度评估
对 reads 抽样，观察不同抽样条件下检测到的转录本数量占检测到的所有转录本的比例（测序饱和度)，并绘制如下曲线。测序饱和度是观察到的文库复杂度的一个度量，当所有转录的mRNA都测序后接近 1.0（100%），即如果曲线末端区域平滑，说明测序接近饱和，再增加测序量，覆盖到的转录本数目也不会显著增加。
- 每个细胞基因中位值
对 reads 抽样，观察不同抽样条件下检测到的每个高质量细胞基因中位值的分布，并绘制如下曲线。如果曲线末端区域平滑，说明测序接近饱和，再增加测序量，检测到的基因数目也不会显著增加。
cellranger aggr 的使用方法
在涉及多个 GEM Well 的大型研究时，分别运行 cellranger count 对每个 GEM Well 的 FASTQ 数据进行分析，然后使用 cellranger aggr 汇总结果。
Tips: 如何理解 GEM Well？
每个 GEM Well 是一组物理上不同的 GEM 分区，但是从有效 barcode 池中随机抽取 barcode 序列，称为 barcode whitelist。为了在整合多个文库时保持 barcode 的唯一性，在 barcode 核苷酸序列中加入一个小整数来识别 GEM，并使用该核苷酸序列和 ID 作为 feature-barcode 矩阵中的唯一标识符。例如，AGACCATTGAGACTTA-1和 AGACCATTGAGACTTA-2 是来自不同 GEM Well 的不同细胞 barcode，尽管它们具有相同的 barcode 核苷酸序列。这个数字说明这个 barcode 序列来自哪个 GEM Well，叫做 GEM Well 后缀。GEM Well 的编号将反映 GEM Well 在 Aggregation CSV 中提供的顺序。
在分析前需要准备一个 csv 文件 libraries.csv：
library_id,molecule_h5
sample1,/public/works/sample1/outs/
molecule_info.h5
sample2,/public/works/sample2/outs/
molecule_info.h5
执行命令：
cellranger aggr \
--id=输出目录名 \
--csv=libraries.csv
cellranger aggr 的结果解读
Output Files：
samples # 目录名称
......
├── outs
│ ├── aggregation.csv # Aggregation CSV 文件
│ ├── analysis # 数据分析文件夹
│ │ ├── clustering # 聚类文件夹，图聚类，k-means 聚类
│ │ ├── diffexp # 差异分析
│ │ ├── pca # pca 线性降维
│ │ ├── tsne # tsne 非线性降维
│ │ └── umap # umap 非线性降维
│ ├── cloupe.cloupe # 用于 Loupe Browser 可视化和分析文件
│ ├── filtered_feature_bc_matrix # 过滤后的 barcode 矩阵信息
│ │ ├── barcodes.tsv.gz
│ │ ├── features.tsv.gz
│ │ └── matrix.mtx.gz
│ ├── filtered_feature_bc_matrix.h5 # 过滤后的 barcode 信息 HDF5 格式
│ ├── raw_feature_bc_matrix # 未经过滤的所有 barcode 的矩阵信息
│ │ ├── barcodes.tsv.gz
│ │ ├── features.tsv.gz
│ │ └── matrix.mtx.gz
│ ├── raw_feature_bc_matrix.h5 # 原始 barcode 信息 HDF5 格式
│ ├── summary.json # 结果汇总 json 文件
│ └── web_summary.html # 结果汇总 html 文件及可视化
以上就是 cellranger count 和 cellranger aggr 的使用方法及结果解读，是不是很实用呢？我们通过三篇文章对 Cell Ranger 进行系统介绍，相信大家对它有了比较深入地了解了。为自己的知识储备又进一步，鼓个掌吧。后续我们还会对 Cell Ranger 分析的特殊案例进行阐述，如插入病毒序列如何分析，混合物种如何分析等，敬请期待~
