20年的一篇circulation research

通讯作者：

1. Both Monocyte-Derived and Resident Macrophages Participate in DiCM Development

Fig 1A：作者首先对5例HC和28例DCM患者的心脏组织进行了免疫荧光染色，发现CD68⁺巨噬细胞显著增多。CD15⁺中性粒和CD3⁺T细胞则没有明显增加。
Fig 1B：作者通过对小鼠注射阿霉素 (15 mg/kg) 构建了DiCM小鼠模型。造模后小鼠外周血和心脏组织的Tnfa, Il1b, Il6持续升高。
Fig 1C, D：和A图一致，流式结果显示DiCM小鼠心脏中的CD45⁺CD11b⁺F4/80⁺巨噬细胞而不是 CD45⁺CD11b⁺F4/80^-Ly6C^-Ly6G⁺ 中性粒细胞出现了持续的增加。(C图是比例，D图是数量)

流式分析策略：
巨噬细胞：CD45⁺CD11b⁺F4/80⁺
Ly6C⁺单核 (circulating monocytes)：CD45⁺CD11b⁺F4/80^-Ly6C⁺Ly6G^-
Ly6C^-单核 (patrolling monocytes)：CD45⁺CD11b⁺F4/80^-Ly6C^-Ly6G^-
中性粒细胞：CD45⁺CD11b⁺F4/80^-Ly6C^-Ly6G⁺

Fig 1E： 为了探究DiCM心脏中增加的巨噬细胞来源，作者使用了共生鼠。作者给共生鼠注射了阿霉素，14天后检测了GFP⁺鼠心脏和外周血中的巨噬细胞。可以看到，对照GFP⁺小鼠外周血中GFP⁺和GFP^-细胞数量类似（血供相通），心脏中则主要还是GFP⁺巨噬。而在诱导了DiCM之后，GFP⁺小鼠心脏中GFP⁺巨噬显著增多，GFP^-巨噬轻度增加。提示 nonmonocyte-derived macrophages may contribute to the accumulated macrophages in DiCM hearts.
Fig 1G： 同时作者也使用了示踪鼠进行了验证。作者使用CX3CR1^CreER/+ Rosatd^TOMATO/+小鼠，阿霉素诱导了DiCM后，对tdTOMATO^-CD45⁺CD11b⁺F4/80⁺外周趋化来的巨噬和tdTOMATO⁺CD45⁺CD11b⁺F4/80⁺ 组织原位巨噬的检测发现外周趋化来的巨噬比例持续减少，组织原位巨噬持续增加。

2. Different Origins of Macrophages Exhibit Distinct Activity and Function in DiCM

由于心脏巨噬细胞具有不同的来源和功能，作者随后想要去探究DiCM中的macrophage origin and metergasis。
Fig 2A： 流式结果显示DiCM组织中，CD45⁺F4/80⁺CD11b⁺Ly6C⁺促炎巨噬显著比修复性CD45⁺F4/80⁺CD11b⁺CD206⁺更多。但随着DiCM进展，这种差异逐渐消失。
Fig 2B： 此外作者发现在CX3CR1^CreER/+ Rosa^tdTOMATO/+ DiCM心脏中，tdTomato⁺CD45⁺CD11b⁺F4/80⁺组织原位巨噬主要向CD206⁺ reparative phenotype分化而tdTomato^-CD45⁺CD11b⁺F4/80⁺主要展示出Ly6C⁺ proinflammatory character。
Fig 2C： 共生鼠的结果也提示GFP+ parabiont 心脏中，F4/80⁺CD11c⁺促炎巨噬主要是monocyte-derived GFP⁻的，而homotypic GFP⁺ 细胞occupied most F4/80⁺CD206⁺ reparative macrophages。
Fig 2D： 随后作者使用氯膦酸盐脂质体清除了巨噬细胞。使用脂质体之后，DiCM心脏中的F4/80⁺总巨噬和CD11C⁺促炎巨噬显著减少，而CD206⁺修复性巨噬则没有受到显著影响。
Fig 2E： 给予氯膦酸盐脂质体之后，DiCM鼠的心功能改善了。
Taken together, these findings indicate that the proinflammatory macrophages are mainly generated from blood monocytes, and their removal may be beneficial in restoring cardiac function in DiCM mice.

随后作者使用骨髓移植验证了前面的结论。
Fig 2F： 作者将GFP⁺ bone marrow cells移植到γ-irradiated wild-type mice，并检测了受体鼠心脏的巨噬细胞。结果显示受体鼠心脏的F4/80⁺CD11C⁺促炎巨噬细胞主要是GFP⁺的，而F4/80⁺CD206⁺修复性巨噬细胞主要是GFP^-的。
Fig 2G-H： 在明确了修复性巨噬主要来源于组织原位巨噬之后，作者探究了DiCM心脏中巨噬细胞的增殖情况。结果显示心脏巨噬细胞存在持续增殖。且增殖阳性的细胞中修复性巨噬占多数，而CD45⁺CD11b⁺F4/80⁺BrdU^-细胞占据了绝大多数的Ly6C⁺促炎巨噬。
Fig 2I： 对tdTomato⁺CD45⁺CD11b⁺F4/80⁺组织原位巨噬和 tdTomato^-CD45⁺CD11b⁺F4/80⁺ 促炎巨噬的增殖监测也显示组织原位巨噬具有更强的增殖活性。

3. SR-A1 Is Required for the Resident Reparative Macrophage Proliferation in DiCM

Fig 3A： 为了探究DiCM心脏中修复性组织原位巨噬细胞增殖的机制，作者对小鼠DiCM心脏进行了RNAseq。结果显示SR-A1是最显著上调的基因之一。（1个对照3个病例吗？而且为什么不提组织原位巨噬来测？）
Fig 3B-C： western和qpcr结果也显示病程中SR-A1持续上调。免疫荧光的结果也显示DCM患者心脏中SR-A1巨噬增加。

We next determined the effect of SR-A1 ablation on macrophage biology in DiCM mice.
Fig 3D-E： 流式结果显示SR-A1敲除鼠DiCM心脏中的巨噬细胞显著增多，CD45⁺CD11b⁺F4/80⁺Ly6C⁺促炎单核增多，Ly6C^- patrolling单核和 CD45⁺CD11b⁺F4/80⁺CD206⁺则减少。
Fig 3F： 与前面的结果一致，qpcr的结果也显示SR-A1^−/− DiCM心脏的促炎活化更显著，修复性基因的表达则较低。

The role of SR-A1 in macrophage proliferation was further assessed by immunofluorescence staining and FACS analysis.
Fig 4A： Ki67⁺CD68⁺的增殖巨噬在SR-A1^−/− DiCM心脏中减少。
Fig 4B-C： 对S期巨噬和CD45⁺CD11b⁺F4/80⁺BrdU⁺巨噬的检测也得到了一致的结果。
Fig 4D： 而且和SR-A1^+/+ controls相比，doxorubicin-administrated SR-A1^−/−心脏中CD45⁺CD11b⁺F4/80⁺Ly6C⁺BrdU⁺促炎巨噬显著更多，CD45⁺CD11b⁺F4/80⁺CD206⁺BrdU⁺修复性巨噬则更低。
Suggesting that SR-A1 deficiency mainly affects the proliferation of reparative macrophages.

随后作者也通过将GFP⁺SR-A1⁺骨髓移植给γ-irradiated GFP^-SR-A1^−/−和GFP^-SR-A1^+/+ 鼠做了验证。
Fig 4E： 结果显示移植给GFP^-SR-A1^+/+ 鼠的心脏中F4/80⁺GFP^-BrdU⁺原位巨噬显著增加，移植给GFP^-SR-A1^−/−鼠的心脏则没有出现这种情况。而且SR-A1 deficiency并没有影响DiCM心脏中F4/80⁺GFP⁺BrdU⁺单核来源的巨噬。
Fig 4F： 而且只有F4/80⁺CD206⁺GFP^-BrdU⁺ 修复性原位巨噬来源的增殖细胞而不是 F4/80⁺CD11c⁺GFP⁺BrdU⁺促炎巨噬来源的增殖细胞在doxorubicin-treated SR-A1^−/− recipients hearts中减少。
These findings collectively indicate that SR-A1 deficiency may only impair resident reparative macrophage proliferation in DiCM hearts.

4. Macrophage SR-A1 Deficiency Exacerbates Doxorubicin-Induced Cardiac Dysfunction and Pathological Remodeling in Mice

由于SR-A1在DiCM心脏中可能参与了修复性组织原位巨噬细胞的增殖，作者随后探究了它对DiCM心脏心功能的影响。结果显示髓系细胞特异性SR-A1^−/−鼠在诱导了DiCM后心功能更差，心肌损伤更重，炎症反应更强，巨噬细胞增殖也下降。

5. SR-A1 Mediates Resident Macrophage Proliferation Through Activation of c-Myc in DiCM

Fig 6A： 为了探究SR-A1影响心功能的下游机制，作者对SR-A1^+/+ DiCM和SR-A1^-/- DiCM心脏进行了RNAseq。其中多个macrophage self-renewal genes, 包括 c-Myc, Klf4, Akt, 和 Stat3在SR-A1^−/− DiCM中下调。
Fig 6B： Silencing c-Myc by RNA interference inhibited cell proliferation in both SR-A1+/+ and SR-A1−/− macrophages。

将SR-A1^+/+和SR-A1^-/-小鼠心脏F4/80⁺巨噬分选出来，转染c-Myc- siRNAs或用Dox-pretreated cardiomyocytes conditioned media (CM) 孵育 24 h），对细胞增殖情况进行了检测。

Fig 6C： 在人DCM心脏中，c-Myc 和 SR-A1在CD68巨噬中也存在共定位。
Fig 6D： Dox预处理心肌细胞的培养基可以诱导SR-A1^+/+巨噬中c-Myc的表达，在SR-A1^-/-巨噬中则无差异。
Fig 6E： 在DiCM小鼠，c-Myc的mRNA水平在修复性巨噬细胞中显著上调，而且这种现象was attenuated by SR-A1 ablation。
Fig 6F： 此外，si掉 c-Myc 在SR-A1^+/+和SR-A1^−/− 巨噬中都抑制了巨噬细胞增殖相关转录因子如PU.1 和 Irf4的表达。
Fig 6G： 然而，c-Myc knockdown并没有影响促炎性巨噬(either F4/80⁺CD11c⁺ or F4/80⁺CD11c⁺BrdU⁺)
Fig 6H： 相反的，SR-A1^+/+巨噬中的c-Myc silencing引起了修复性巨噬 (both F4/80⁺CD206⁺ 和 F4/80⁺CD206⁺BrdU⁺) 的显著下降，这个效应was blunted by SR-A1 deficiency。
Fig 6I： The indispensable role of SR-A1 and c-Myc in the proliferation of reparative macrophages was also confirmed by EdU staining
Fig 6J： 此外，在使用doxorubicin预处理心肌细胞的条件培养基刺激后，c-Myc在SR-A1+/+ macrophages的核中显著聚集。在SR-A1^−/− macrophages中则没有。

Collectively, these findings suggest that SR-A1 may mediate resident reparative macrophage proliferation through the TAK1-MKK4 (MAPK kinase kinase 4)-P38-c-Myc-SIRT1 pathway in DiCM. （附件）

6. Selective Manipulation of Macrophage c-Myc Influences Murine DiCM Progression

Fig 7A： 为了进一步明确SR-A1-c-Myc通路在DiCM病理过程中的作用，沉默或过表达巨噬细胞c-Myc的慢病毒was produced using the SP-C1 promoter。

SP-C1看起来是巨噬细胞特异性启动子，可以拿来做lentivirus

Fig 7B-D： c-Myc的 Knock-down 抑制了巨噬细胞增殖，恶化了DiCM的心功能，而且这种现象在SR-A1^−/−鼠中更显著。
Fig 7E-G： 反过来，过表达c-Myc 刺激了巨噬细胞增殖，并在SR-A1^+/+和 SR-A1^−/−鼠中都显著恢复了doxorubicin-impaired 心功能。

As such, these results reveal that c-Myc confers a beneficial action to antagonize DiCM development by promoting reparative macrophage proliferation.

用的鼠子和流式的做法